Tak for dit besøg på nature.com. Den browserversion, du bruger, har begrænset CSS-understøttelse. For at opnå den bedste oplevelse anbefaler vi at bruge den nyeste browserversion (eller deaktivere kompatibilitetstilstand i Internet Explorer). Derudover vil dette websted være fri for stilarter og JavaScript for at sikre fortsat support.
Skeletmuskulatur er et heterogent væv, der overvejende består af myofibriller, som hos mennesker typisk klassificeres i tre typer: en "langsom" (type 1) og to "hurtige" (type 2A og 2X). Imidlertid er heterogeniteten mellem og inden for traditionelle myofibriltyper fortsat dårligt forstået. Vi anvendte transkriptomiske og proteomiske tilgange på henholdsvis 1050 og 1038 individuelle myofibriller fra den humane vastus lateralis. Det proteomiske studie omfattede mænd, og det transkriptomiske studie omfattede 10 mænd og 2 kvinder. Ud over myosin tungkæde-isoformer identificerede vi metaboliske proteiner, ribosomale proteiner og cellulære junctionale proteiner som kilder til multidimensionel intermyofibrilvariabilitet. Desuden, på trods af identifikationen af klynger af langsomme og hurtige fibre, tyder vores data på, at type 2X-fibre fænotypisk ikke kan skelnes fra andre hurtige fibre. Desuden er myosin tungkæde-baseret klassificering utilstrækkelig til at beskrive myofiberfænotypen i nemaline myopatier. Samlet set tyder vores data på multidimensionel myofiber-heterogenitet, med variationskilder, der strækker sig ud over myosin tungkæde-isoformer.
Cellulær heterogenitet er et iboende træk ved alle biologiske systemer, der tillader celler at specialisere sig for at imødekomme de forskellige behov hos væv og celler.1 Den traditionelle opfattelse af heterogenitet i skeletmuskulaturfibre har været, at motorneuroner definerer fibertypen inden for en motorisk enhed, og at fibertypen (dvs. type 1, type 2A og type 2X hos mennesker) bestemmes af karakteristikaene for myosin tungkæde (MYH) isoformer.2 Dette var oprindeligt baseret på deres pH ATPase-ustabilitet,3,4 og senere på deres molekylære ekspression af MYH.5 Men med identifikationen og den efterfølgende accept af "blandede" fibre, der udtrykker flere MYH'er i varierende proportioner, ses skeletmuskulaturfibre i stigende grad som et kontinuum snarere end som forskellige fibertyper.6 På trods af dette er feltet stadig stærkt afhængigt af MYH som den primære klassifikator for myofiberklassificering, en opfattelse, der sandsynligvis er påvirket af begrænsningerne og betydelige bias i tidlige gnaverstudier, hvis MYH-ekspressionsprofiler og udvalg af fibertyper adskiller sig fra dem hos mennesker.2 Situationen kompliceres yderligere af, at forskellige menneskelige skeletmuskler udviser en bred vifte af fibertyper.7 vastus lateralis er en blandet muskel med en mellemliggende (og derfor repræsentativ) MYH-ekspressionsprofil.7 Desuden gør dens nemme prøveudtagning den til den bedst undersøgte muskel hos mennesker.
Således er upartisk undersøgelse af skeletmuskelfibres diversitet ved hjælp af kraftfulde "omics"-værktøjer kritisk, men også udfordrende, delvist på grund af skeletmuskelfibres multinukleære natur. Imidlertid har transkriptomics8,9 og proteomics10-teknologier gennemgået en revolution i følsomhed i de senere år på grund af forskellige teknologiske fremskridt, der muliggør analyse af skeletmuskulatur ved enkeltfiberopløsning. Som et resultat er der gjort betydelige fremskridt med at karakterisere enkeltfiberdiversitet og deres respons på atrofiske stimuli og aldring11,12,13,14,15,16,17,18. Det er vigtigt at bemærke, at disse teknologiske fremskridt har kliniske anvendelser, der muliggør en mere detaljeret og præcis karakterisering af sygdomsassocieret dysregulering. For eksempel er patofysiologien af nemalinmyopati, en af de mest almindelige arvelige muskelsygdomme (MIM 605355 og MIM 161800), kompleks og forvirrende.19,20 Derfor kan en bedre karakterisering af dysreguleringen af skeletmuskelfibre føre til betydelige fremskridt i vores forståelse af denne sygdom.
Vi udviklede metoder til transkriptomisk og proteomisk analyse af enkelte skeletmuskelfibre, der manuelt blev isoleret fra humane biopsiprøver, og anvendte dem på tusindvis af fibre, hvilket gjorde det muligt for os at undersøge den cellulære heterogenitet af humane skeletmuskelfibre. I løbet af dette arbejde demonstrerede vi styrken af transkriptomisk og proteomisk fænotypning af muskelfibre og identificerede metaboliske, ribosomale og cellulære forbindelsesproteiner som betydelige kilder til interfibervariabilitet. Desuden karakteriserede vi ved hjælp af denne proteomiske arbejdsgang den kliniske relevans af nematodemyopati i enkelte skeletmuskelfibre, hvilket afslørede et koordineret skift mod ikke-oxidative fibre uafhængigt af fibertype baseret på MYH.
For at undersøge heterogeniteten af humane skeletmuskelfibre udviklede vi to arbejdsgange, der muliggør transkriptom- og proteomanalyse af enkelte skeletmuskelfibre (figur 1A og supplerende figur 1A). Vi udviklede og optimerede adskillige metodologiske trin, fra prøveopbevaring og konservering af RNA- og proteinintegritet til optimering af gennemløbshastigheden for hver tilgang. Til transkriptomanalyse blev dette opnået ved at indsætte prøvespecifikke molekylære stregkoder i det indledende trin af revers transkription, hvilket gjorde det muligt at samle 96 fibre til effektiv downstream-behandling. Dybere sekventering (±1 million aflæsninger pr. fiber) sammenlignet med traditionelle enkeltcelletilgange berigede yderligere transkriptomdataene.21 Til proteomics anvendte vi en kort kromatografisk gradient (21 minutter) kombineret med DIA-PASEF-dataopsamling på et timsTOF-massespektrometer for at optimere proteomdybden, samtidig med at der opretholdes en høj gennemløbshastighed. 22,23 For at undersøge heterogeniteten af sunde skeletmuskelfibre karakteriserede vi transkriptomerne fra 1.050 individuelle fibre fra 14 raske voksne donorer og proteomerne fra 1.038 fibre fra 5 raske voksne donorer (Supplerende Tabel 1). I denne artikel omtales disse datasæt som henholdsvis 1.000-fiber transkriptomer og proteomer. Vores tilgang detekterede i alt 27.237 transkripter og 2.983 proteiner i de transkriptomiske og proteomiske analyser af 1.000 fibre (Figur 1A, Supplerende Datasæt 1-2). Efter filtrering af de transkriptomiske og proteomiske datasæt for >1.000 detekterede gener og 50% gyldige værdier pr. fiber, blev efterfølgende bioinformatiske analyser udført for henholdsvis 925 og 974 fibre i transkriptomet og proteomet. Efter filtrering blev der detekteret et gennemsnit på 4257 ± 1557 gener og 2015 ± 234 proteiner (gennemsnit ± SD) pr. fiber, med begrænset interindividuel variation (Supplerende figurer 1B-C, supplerende datasæt 3-4). Imidlertid var variationen inden for forsøgspersonerne mere udtalt på tværs af deltagerne, sandsynligvis på grund af forskelle i RNA/proteinudbytte mellem fibre med forskellige længder og tværsnitsarealer. For de fleste proteiner (>2000) var variationskoefficienten under 20% (Supplerende figur 1D). Begge metoder tillod at indfange et bredt dynamisk område af transkripter og proteiner med højt udtrykte signaturer, der er vigtige for muskelkontraktion (f.eks. ACTA1, MYH2, MYH7, TNNT1, TNNT3) (Supplerende figurer 1E-F). De fleste af de identificerede træk var fælles mellem de transkriptomiske og proteomiske datasæt (Supplerende figur 1G), og de gennemsnitlige UMI/LFQ-intensiteter af disse træk var rimeligt godt korreleret (r = 0,52) (Supplerende figur 1H).
Transkriptomik- og proteomik-workflow (oprettet med BioRender.com). BD Dynamiske områdekurver for MYH7, MYH2 og MYH1 og beregnede tærskler for fibertypetildeling. E, F Fordeling af MYH-ekspression på tværs af fibre i transkriptomik- og proteomik-datasæt. G, H Uniform Diversity Approximation and Projection (UMAP)-plots for transkriptomik og proteomik farvet efter MYH-baseret fibertype. I, J Feature-plots, der viser MYH7-, MYH2- og MYH1-ekspression i transkriptomik- og proteomik-datasæt.
Vi satte os oprindeligt for at tildele MYH-baseret fibertype til hver fiber ved hjælp af en optimeret tilgang, der udnytter den høje følsomhed og det dynamiske område af MYH-ekspression i omics-datasæt. Tidligere undersøgelser har brugt vilkårlige tærskler til at mærke fibre som ren type 1, type 2A, type 2X eller blandet baseret på en fast procentdel af ekspression af forskellige MYH'er11,14,24. Vi brugte en anden tilgang, hvor ekspressionen af hver fiber blev rangeret efter de MYH'er, vi brugte til at typebestemme fibrene: MYH7, MYH2 og MYH1, svarende til henholdsvis type 1-, type 2A- og type 2X-fibre. Vi beregnede derefter matematisk det nedre vendepunkt for hver resulterende kurve og brugte det som en tærskel til at tildele fibre som positive (over tærsklen) eller negative (under tærsklen) for hver MYH (Figur 1B-D). Disse data viser, at MYH7 (Figur 1B) og MYH2 (Figur 1C) har mere distinkte on/off-ekspressionsprofiler på RNA-niveau sammenlignet med proteinniveau. På proteinniveau var der faktisk meget få fibre, der ikke udtrykte MYH7, og ingen fibre havde 100 % MYH2-ekspression. Vi brugte derefter forudbestemte ekspressionstærskler til at tildele MYH-baserede fibertyper til alle fibre i hvert datasæt. For eksempel blev MYH7+/MYH2-/MYH1- fibre tildelt type 1, mens MYH7-/MYH2+/MYH1+ fibre blev tildelt blandet type 2A/2X (se supplerende tabel 2 for en fuldstændig beskrivelse). Ved at samle alle fibre observerede vi en bemærkelsesværdigt lignende fordeling af MYH-baserede fibertyper på både RNA- (figur 1E) og protein- (figur 1F) niveauer, mens den relative sammensætning af MYH-baserede fibertyper varierede på tværs af individer, som forventet (supplerende figur 2A). De fleste fibre blev klassificeret som enten ren type 1 (34-35 %) eller type 2A (36-38 %), selvom et betydeligt antal blandede type 2A/2X fibre også blev detekteret (16-19 %). En slående forskel er, at rene type 2X-fibre kun kunne detekteres på RNA-niveau, men ikke på proteinniveau, hvilket tyder på, at hurtig MYH-ekspression i det mindste delvist reguleres post-transkriptionelt.
Vi validerede vores proteomikbaserede MYH-fibertypningsmetode ved hjælp af antistofbaseret dot blotting, og begge metoder opnåede 100 % overensstemmelse i identifikationen af rene type 1- og type 2A-fibre (se supplerende figur 2B). Den proteomikbaserede tilgang var imidlertid mere følsom og effektiv til at identificere blandede fibre og kvantificere andelen af hvert MYH-gen i hver fiber. Disse data demonstrerer effektiviteten af at anvende en objektiv, meget følsom omikbaseret tilgang til at karakterisere skeletmuskelfibertyper.
Vi brugte derefter den kombinerede information fra transkriptomik og proteomik til objektivt at klassificere myofibre baseret på deres komplette transkriptom eller proteom. Ved at bruge UMAP-metoden (uniform manifold approximation and projection) til at reducere dimensionaliteten til seks hovedkomponenter (Supplerende figur 3A-B) var vi i stand til at visualisere myofibervariabiliteten i transkriptomet (Figur 1G) og proteomet (Figur 1H). Bemærkelsesværdigt blev myofibre ikke grupperet efter deltagere (Supplerende figur 3C-D) eller testdage (Supplerende figur 3E) i hverken transkriptomik- eller proteomik-datasættene, hvilket tyder på, at variationen i skeletmuskelfibre inden for forsøgspersonerne er højere end variationen mellem forsøgspersonerne. I UMAP-plottet fremkom to forskellige klynger, der repræsenterer "hurtige" og "langsomme" myofibre (Figur 1G-H). MYH7+ (langsomme) myofibre var grupperet ved den positive pol af UMAP1, hvorimod MYH2+ og MYH1+ (hurtige) myofibre var grupperet ved den negative pol af UMAP1 (figur 1I-J). Der blev dog ikke skelnet mellem hurtige fibertyper (dvs. type 2A, type 2X eller blandet 2A/2X) baseret på MYH-ekspression, hvilket tyder på, at MYH1-ekspressionen (figur 1I-J) eller andre klassiske 2X myofibermarkører såsom ACTN3- eller MYLK2-ekspressionen (supplerende figurer 4A-B) ikke differentierer mellem forskellige myofibertyper, når man betragter hele transkriptomet eller proteomet. Desuden var der få transkripter eller proteiner, der var positivt korreleret med MYH1 sammenlignet med MYH2 og MYH7 (supplerende figurer 4C-H), hvilket tyder på, at MYH1-forekomsten ikke fuldt ud afspejler myofibertranskriptomet/proteomet. Lignende konklusioner blev nået ved vurdering af den blandede ekspression af de tre MYH-isoformer på UMAP-niveau (supplerende fig. 4I-J). Selvom 2X-fibre kan identificeres på transkriptniveau alene baseret på MYH-kvantificering, kan MYH1+-fibre således ikke skelnes fra andre hurtige fibre, når man betragter hele transkriptomet eller proteomet.
Som en indledende undersøgelse af heterogenitet i langsomme fibre ud over MYH, vurderede vi fire etablerede langsomme fibertypespecifikke proteiner: TPM3, TNNT1, MYL3 og ATP2A22. Langsomme fibersubtyper viste høje, men ikke perfekte, Pearson-korrelationer med MYH7 i både transkriptomik (Supplerende Figur 5A) og proteomik (Supplerende Figur 5B). Cirka 25 % og 33 % af de langsomme fibre blev ikke klassificeret som rene langsomme fibre af alle gen/proteinsubtyper i henholdsvis transkriptomik (Supplerende Figur 5C) og proteomik (Supplerende Figur 5D). Derfor introducerer klassificering af langsomme fibre baseret på flere gen/proteinsubtyper yderligere kompleksitet, selv for proteiner, der vides at være fibertypespecifikke. Dette antyder, at fiberklassificering baseret på isoformer af en enkelt gen/proteinfamilie muligvis ikke tilstrækkeligt afspejler den sande heterogenitet af skeletmuskelfibre.
For yderligere at undersøge den fænotypiske variation af humane skeletmuskelfibre på skalaen af hele omics-modellen, udførte vi objektiv dimensionalitetsreduktion af dataene ved hjælp af principal component analysis (PCA) (Figur 2A). I lighed med UMAP-plot påvirkede hverken deltager eller testdag fiberklynger på PCA-niveau (Supplerende Figurer 6A-C). I begge datasæt blev MYH-baseret fibertype forklaret af PC2, som viste en klynge af slow-twitch type 1-fibre og en anden klynge indeholdende fast-twitch type 2A, type 2X og blandede 2A/2X-fibre (Figur 2A). I begge datasæt var disse to klynger forbundet af et lille antal blandede type 1/2A-fibre. Som forventet bekræftede overrepræsentationsanalyse af de vigtigste PC-drivere, at PC2 var drevet af kontraktile og metaboliske signaturer (Figur 2B og Supplerende Figurer 6D-E, Supplerende Datasæt 5-6). Samlet set blev MYH-baseret fibertype fundet at være tilstrækkelig til at forklare kontinuerlig variation langs PC2, med undtagelse af såkaldte 2X-fibre, der var fordelt i hele transkriptomet inden for den hurtige klynge.
A. Principal component analysis (PCA) plots af transkriptom- og proteomdatasæt farvet efter fibertype baseret på MYH. B. Berigelsesanalyse af transkript- og proteindrivere i PC2 og PC1. Statistisk analyse blev udført ved hjælp af clusterProfiler-pakken og Benjamini-Hochberg-justerede p-værdier. C, D. PCA-plots farvet efter intercellulære adhæsionsgenontologi (GO)-termer i transkriptomet og costamere GO-termer i proteomet. Pile repræsenterer transkript- og proteindrivere og deres retninger. E, F. Uniform manifold approximation and projection (UMAP) plots af klinisk relevante funktioner, der viser ekspressionsgradienter uafhængigt af langsom/hurtig fibertype. G, H. Korrelationer mellem PC2- og PC1-drivere i transkriptomer og proteomer.
Uventet forklarede MYH-baseret myofibertype kun den næsthøjeste grad af variation (PC2), hvilket tyder på, at andre biologiske faktorer, der ikke er relateret til MYH-baseret myofibertype (PC1), spiller en vigtig rolle i reguleringen af heterogenitet i skeletmuskulaturfibre. Overrepræsentationsanalyse af de vigtigste drivere i PC1 viste, at variationen i PC1 primært blev bestemt af celle-celle-adhæsion og ribosomindhold i transkriptomet samt costamerer og ribosomale proteiner i proteomet (Figur 2B og Supplerende Figurer 6D-E, Supplerende Datasæt 7). I skeletmuskulatur forbinder costamerer Z-skiven med sarkolemmaet og er involveret i krafttransmission og signalering. 25 Annoterede PCA-plots ved hjælp af celle-celle-adhæsion (transkriptom, Figur 2C) og costamer (proteom, Figur 2D) funktioner afslørede et stærkt venstreskift i PC1, hvilket indikerer, at disse funktioner er beriget i visse fibre.
En mere detaljeret undersøgelse af myofiberklynger på UMAP-niveau afslørede, at de fleste træk udviste en myofibertype-uafhængig MYH-baseret ekspressionsgradient snarere end myofiber-subklyngespecifik. Denne kontinuitet blev observeret for flere gener forbundet med patologiske tilstande (Figur 2E), såsom CHCHD10 (neuromuskulær sygdom), SLIT3 (muskelatrofi), CTDNEP1 (muskelsygdom). Denne kontinuitet blev også observeret på tværs af proteomet, herunder proteiner forbundet med neurologiske lidelser (UGDH), insulinsignalering (PHIP) og transkription (HIST1H2AB) (Figur 2F). Samlet set indikerer disse data kontinuitet i fibertype-uafhængig langsom/hurtig rykningsheterogenitet på tværs af forskellige myofibre.
Interessant nok viste drivergener i PC2 god transkriptom-proteom-korrelation (r = 0,663) (Figur 2G), hvilket tyder på, at langsomme og hurtige fibertyper, og især de kontraktile og metaboliske egenskaber af skeletmuskelfibre, er transkriptionelt reguleret. Drivergener i PC1 viste imidlertid ingen transkriptom-proteom-korrelation (r = -0,027) (Figur 2H), hvilket tyder på, at variationer, der ikke er relateret til langsomme/hurtige fibertyper, i vid udstrækning reguleres post-transkriptionelt. Fordi variationer i PC1 primært blev forklaret af ribosomale genontologiske termer, og i betragtning af at ribosomer spiller en afgørende og specialiseret rolle i cellen ved aktivt at deltage i og påvirke proteintranslation,31 satte vi os derefter for at undersøge denne uventede ribosomale heterogenitet.
Vi farvede først plottet for proteomics principal component analyse i henhold til den relative mængde proteiner i GOCC-termen "cytoplasmatisk ribosom" (Figur 3A). Selvom denne term er beriget på den positive side af PC1, hvilket resulterer i en lille gradient, driver ribosomale proteiner partitionering i begge retninger af PC1 (Figur 3A). Ribosomale proteiner beriget på den negative side af PC1 omfattede RPL18, RPS18 og RPS13 (Figur 3B), mens RPL31, RPL35 og RPL38 (Figur 3C) var de vigtigste drivkræfter på den positive side af PC1. Interessant nok var RPL38 og RPS13 i høj grad udtrykt i skeletmuskulatur sammenlignet med andre væv (Supplerende Figur 7A). Disse karakteristiske ribosomale signaturer i PC1 blev ikke observeret i transkriptomet (Supplerende Figur 7B), hvilket indikerer post-transkriptionel regulering.
A. Principal component analysis (PCA) plot farvet i henhold til cytoplasmatiske ribosomale genontologi (GO) termer på tværs af proteomet. Pile angiver retningen af proteinmedieret variation i PCA-plottet. Linjelængden svarer til principal component scoren for et givet protein. B, C. PCA-funktionsplots for RPS13 og RPL38. D. Uovervåget hierarkisk klyngeanalyse af cytoplasmatiske ribosomale proteiner. E. Strukturel model af 80S ribosomet (PDB: 4V6X), der fremhæver ribosomale proteiner med forskellig forekomst i skeletmuskelfibre. F. Ribosomale proteiner med forskellig støkiometri lokaliseret nær mRNA-udgangskanalen.
Begreberne ribosomal heterogenitet og specialisering er tidligere blevet foreslået, hvor tilstedeværelsen af forskellige ribosom-subpopulationer (ribosomal heterogenitet) direkte kan påvirke proteintranslation i forskellige væv32 og celler33 gennem selektiv translation af specifikke mRNA-transkriptpuljer34 (ribosomspecialisering). For at identificere subpopulationer af ribosomale proteiner, der co-udtrykkes i skeletmuskelfibre, udførte vi en uovervåget hierarkisk klyngeanalyse af ribosomale proteiner i proteomet (Figur 3D, Supplerende Datasæt 8). Som forventet klyngede ribosomale proteiner sig ikke efter fibertype baseret på MYH. Vi identificerede dog tre forskellige klynger af ribosomale proteiner; den første klynge (ribosomal_cluster_1) er koreguleret med RPL38 og har derfor øget ekspression i fibre med en positiv PC1-profil. Den anden klynge (ribosomal_cluster_2) er koreguleret med RPS13 og er forhøjet i fibre med en negativ PC1-profil. Den tredje klynge (ribosomal_cluster_3) viser ikke koordineret differentiel ekspression i skeletmuskulaturfibre og kan betragtes som det "kerne" ribosomale protein i skeletmuskulaturen. Både ribosomalklynger 1 og 2 indeholder ribosomale proteiner, der tidligere har vist sig at regulere alternativ translation (f.eks. RPL10A, RPL38, RPS19 og RPS25) og funktionelt påvirke udviklingen (f.eks. RPL10A, RPL38).34,35,36,37,38 I overensstemmelse med PCA-resultaterne viste den observerede heterogene repræsentation af disse ribosomale proteiner på tværs af fibrene også kontinuitet (Supplerende figur 7C).
For at visualisere placeringen af heterogene ribosomale proteiner i ribosomet anvendte vi en strukturel model af det humane 80S ribosom (Protein Data Bank: 4V6X) (Figur 3E). Efter isolering af ribosomale proteiner, der tilhørte forskellige ribosomale klynger, var deres placeringer ikke tæt på hinanden, hvilket tyder på, at vores tilgang ikke gav berigelse for bestemte regioner/fraktioner af ribosomet. Interessant nok var andelen af store subunitproteiner i klynge 2 dog lavere end i klynge 1 og 3 (Supplerende Figur 7D). Vi observerede, at proteiner med ændret støkiometri i skeletmuskelfibre overvejende var lokaliseret til ribosomoverfladen (Figur 3E), hvilket stemmer overens med deres evne til at interagere med interne ribosom-entry site (IRES)-elementer i forskellige mRNA-populationer og derved koordinere selektiv translation. 40, 41 Desuden var mange proteiner med ændret støkiometri i skeletmuskelfibre placeret i nærheden af funktionelle regioner såsom mRNA-udgangstunnelen (Figur 3F), som selektivt regulerer translationel forlængelse og arrestering af specifikke peptider. 42 Sammenfattende tyder vores data på, at støkiometrien af ribosomale proteiner i skeletmuskulaturen udviser heterogenitet, hvilket resulterer i forskelle mellem skeletmuskelfibre.
Vi satte os derefter for at identificere hurtige og langsomme fibersignaturer og udforske mekanismerne bag deres transkriptionelle regulering. Ved at sammenligne de hurtige og langsomme fiberklynger defineret af UMAP i de to datasæt (figur 1G-H og 4A-B) identificerede transkriptomiske og proteomiske analyser henholdsvis 1366 og 804 differentielt rigelige træk (figur 4A-B, supplerende datasæt 9-12). Vi observerede de forventede forskelle i signaturer relateret til sarkomerer (f.eks. tropomyosin og troponin), excitation-kontraktionskobling (SERCA-isoformer) og energimetabolisme (f.eks. ALDOA og CKB). Desuden blev transkripter og proteiner, der regulerer proteinubiquitinering, differentielt udtrykt i hurtige og langsomme fibre (f.eks. USP54, SH3RF2, USP28 og USP48) (figur 4A-B). Desuden var det mikrobielle proteingen RP11-451G4.2 (DWORF), som tidligere har vist sig at være differentielt udtrykt på tværs af lammemuskelfibertyper43 og forstærker SERCA-aktivitet i hjertemuskulatur44, signifikant opreguleret i langsomme skeletmuskelfibre (Figur 4A). Tilsvarende blev der på individuelt fiberniveau observeret signifikante forskelle i kendte signaturer såsom metabolisme-relaterede laktatdehydrogenase-isoformer (LDHA og LDHB, Figur 4C og Supplerende Figur 8A)45,46 samt tidligere ukendte fibertypespecifikke signaturer (såsom IRX3, USP54, USP28 og DPYSL3) (Figur 4C). Der var en signifikant overlapning af differentielt udtrykte træk mellem de transkriptomiske og proteomiske datasæt (Supplerende Figur 8B), samt en foldændringskorrelation primært drevet af den mere udtalte differentielle ekspression af sarkomertræk (Supplerende Figur 8C). Det er værd at bemærke, at nogle signaturer (f.eks. USP28, USP48, GOLGA4, AKAP13) kun udviste stærk post-transkriptionel regulering på proteomisk niveau og havde langsomme/hurtige twitch-fibertypespecifikke ekspressionsprofiler (supplerende figur 8C).
A og B vulkanplot, der sammenligner langsomme og hurtige klynger identificeret ved hjælp af UMAP-plottene (uniform manifold approximation and projection) i figur 1G-H. Farvede prikker repræsenterer transkripter eller proteiner, der er signifikant forskellige ved FDR < 0,05, og mørkere prikker repræsenterer transkripter eller proteiner, der er signifikant forskellige ved logaritmisk ændring > 1. Tovejs statistisk analyse blev udført ved hjælp af DESeq2 Wald-testen med Benjamini-Hochberg-justerede p-værdier (transkriptomik) eller Limma lineær modelmetode med empirisk Bayesiansk analyse efterfulgt af Benjamini-Hochberg-justering for multiple sammenligninger (proteomik). C Signaturplot af udvalgte differentielt udtrykte gener eller proteiner mellem langsomme og hurtige fibre. D Berigelsesanalyse af signifikant differentielt udtrykte transkripter og proteiner. Overlappende værdier er beriget i begge datasæt, transkriptomværdier er kun beriget i transkriptomet, og proteomværdier er kun beriget i proteomet. Statistisk analyse blev udført ved hjælp af clusterProfiler-pakken med Benjamini-Hochberg-justerede p-værdier. E. Fibertypespecifikke transkriptionsfaktorer identificeret af SCENIC baseret på SCENIC-afledte regulatorspecificitetsscorer og differentiel mRNA-ekspression mellem fibertyper. F. Profilering af udvalgte transkriptionsfaktorer, der udtrykkes differentielt mellem langsomme og hurtige fibre.
Vi udførte derefter en overrepræsentationsanalyse af differentielt repræsenterede gener og proteiner (Figur 4D, Supplerende Datasæt 13). Berigelse af signalveje for funktioner, der afveg mellem de to datasæt, afslørede forventede forskelle, såsom fedtsyre-β-oxidation og ketonmetabolismeprocesser (langsomme fibre), myofilament-/muskelkontraktion (henholdsvis hurtige og langsomme fibre) og kulhydratkataboliske processer (hurtige fibre). Serin/threonin-proteinfosfataseaktivitet var også forhøjet i hurtige fibre, drevet af funktioner såsom de regulatoriske og katalytiske fosfatase-underenheder (PPP3CB, PPP1R3D og PPP1R3A), som er kendt for at regulere glykogenmetabolisme (47) (Supplerende Figurer 8D-E). Andre signalveje beriget med hurtige fibre omfattede processing (P-) bodies (YTHDF3, TRIM21, LSM2) i proteomet (supplerende figur 8F), potentielt involveret i post-transkriptionel regulering (48), og transkriptionsfaktoraktivitet (SREBF1, RXRG, RORA) i transkriptomet (supplerende figur 8G). Langsomme fibre var beriget med oxidoreduktaseaktivitet (BDH1, DCXR, TXN2) (supplerende figur 8H), amidbinding (CPTP, PFDN2, CRYAB) (supplerende figur 8I), ekstracellulær matrix (CTSD, ADAMTSL4, LAMC1) (supplerende figur 8J) og receptor-ligandaktivitet (FNDC5, SPX, NENF) (supplerende figur 8K).
For at få yderligere indsigt i den transkriptionelle regulering, der ligger til grund for langsomme/hurtige muskelfibre, udførte vi en transkriptionsfaktorberigelsesanalyse ved hjælp af SCENIC49 (Supplerende datasæt 14). Mange transkriptionsfaktorer var signifikant beriget mellem hurtige og langsomme muskelfibre (Figur 4E). Dette omfattede transkriptionsfaktorer såsom MAFA, som tidligere er blevet forbundet med hurtig muskelfiberudvikling,50 samt adskillige transkriptionsfaktorer, der ikke tidligere har været forbundet med muskelfibertypespecifikke genprogrammer. Blandt disse var PITX1, EGR1 og MYF6 de mest berigede transkriptionsfaktorer i hurtige muskelfibre (Figur 4E). I modsætning hertil var ZSCAN30 og EPAS1 (også kendt som HIF2A) de mest berigede transkriptionsfaktorer i langsomme muskelfibre (Figur 4E). I overensstemmelse med dette blev MAFA udtrykt på højere niveauer i UMAP-regionen svarende til hurtige muskelfibre, mens EPAS1 havde det modsatte ekspressionsmønster (Figur 4F).
Ud over kendte proteinkodende gener er der adskillige ikke-kodende RNA-biotyper, der kan være involveret i reguleringen af menneskelig udvikling og sygdom. 51, 52 I transkriptomdatasæt udviser adskillige ikke-kodende RNA'er fibertypespecificitet (figur 5A og supplerende datasæt 15), herunder LINC01405, som er yderst specifik for langsomme fibre og rapporteres at være nedsat i muskel hos patienter med mitokondriel myopati. 53 I modsætning hertil udviser RP11-255P5.3, svarende til lnc-ERCC5-5-genet (https://lncipedia.org/db/transcript/lnc-ERCC5-5:2) 54, hurtig fibertypespecificitet. Både LINC01405 (https://tinyurl.com/x5k9wj3h) og RP11-255P5.3 (https://tinyurl.com/29jmzder) udviser skeletmuskelspecificitet (supplerende figurer 9A-B) og har ingen kendte kontraktile gener inden for deres 1 Mb genomiske nabolag, hvilket tyder på, at de spiller en specialiseret rolle i reguleringen af fibertyper snarere end reguleringen af tilstødende kontraktile gener. De langsomme/hurtige fibertypespecifikke ekspressionsprofiler for henholdsvis LINC01405 og RP11-255P5.3 blev bekræftet ved hjælp af RNAscope (figurer 5B-C).
A. Ikke-kodende RNA-transkripter er signifikant reguleret i langsomme og hurtige muskelfibre. B. Repræsentative RNAscope-billeder, der viser henholdsvis LINC01405 og RP11-255P5.3's langsomme og hurtige fibertypespecificitet. Skalalinje = 50 μm. C. Kvantificering af myofibertypespecifik ikke-kodende RNA-ekspression som bestemt af RNAscope (n = 3 biopsier fra uafhængige individer, der sammenligner hurtige og langsomme muskelfibre inden for hvert individ). Statistisk analyse blev udført ved hjælp af en tosidet Student's t-test. Boksplots viser medianen og den første og tredje kvartil, med whiskers pegende på minimums- og maksimumværdierne. D. De novo mikrobiel proteinidentifikationsworkflow (oprettet med BioRender.com). E. Det mikrobielle protein LINC01405_ORF408:17441:17358 udtrykkes specifikt i langsomme skeletmuskelfibre (n = 5 biopsier fra uafhængige deltagere, der sammenligner hurtige og langsomme muskelfibre hos hver deltager). Statistisk analyse blev udført ved hjælp af Limms lineære modelmetode kombineret med en empirisk Bayesiansk tilgang, efterfulgt af Benjamini-Hochberg-metoden til multiple sammenligninger med p-værdijustering. Boksdiagrammer viser medianen, første og tredje kvartil, hvor whiskers peger på maksimum-/minimumværdierne.
For nylig har undersøgelser vist, at mange formodede ikke-kodende transkripter koder for transkriberede mikrobielle proteiner, hvoraf nogle regulerer muskelfunktionen. 44, 55 For at identificere mikrobielle proteiner med potentiel fibertypespecificitet søgte vi i vores 1000-fiberproteomdatasæt ved hjælp af en brugerdefineret FASTA-fil, der indeholder sekvenserne af ikke-kodende transkripter (n = 305) fundet i 1000-fibertranskriptomdatasættet (Figur 5D). Vi identificerede 197 mikrobielle proteiner fra 22 forskellige transkripter, hvoraf 71 var differentielt reguleret mellem langsomme og hurtige skeletmuskelfibre (Supplerende Figur 9C og Supplerende Datasæt 16). For LINC01405 blev der identificeret tre mikrobielle proteinprodukter, hvoraf det ene viste lignende langsom fiberspecificitet som dets transkript (Figur 5E og Supplerende Figur 9D). Således identificerede vi LINC01405 som et gen, der koder for et mikrobielt protein specifikt for langsomme skeletmuskelfibre.
Vi udviklede en omfattende arbejdsgang til storstilet proteomisk karakterisering af individuelle muskelfibre og identificerede regulatorer af fiberheterogenitet i raske tilstande. Vi anvendte denne arbejdsgang til at forstå, hvordan nemaline myopatier påvirker heterogeniteten af skeletmuskelfibre. Nemaline myopatier er arvelige muskelsygdomme, der forårsager muskelsvaghed og hos berørte børn præsenterer sig med en række komplikationer, herunder åndedrætsbesvær, skoliose og begrænset mobilitet i lemmerne.19,20 Typisk resulterer patogene varianter i gener som actin alpha 1 (ACTA1) i nemaline myopatier i en overvægt af langsomt rykkende fibermyofibersammensætning, selvom denne effekt er heterogen. En bemærkelsesværdig undtagelse er troponin T1 nemalin myopati (TNNT1), som har en overvægt af hurtige fibre. Således kan en bedre forståelse af den heterogenitet, der ligger til grund for den skeletmuskelfiberdysregulering, der observeres i nemaline myopatier, bidrage til at opklare det komplekse forhold mellem disse sygdomme og myofibertype.
Sammenlignet med raske kontrolpersoner (n=3 pr. gruppe) udviste myofibre isoleret fra patienter med nemalin myopati med mutationer i ACTA1- og TNNT1-generne markant myofiberatrofi eller -dystrofi (Figur 6A, Supplerende Tabel 3). Dette præsenterede betydelige tekniske udfordringer for proteomisk analyse på grund af den begrænsede mængde tilgængeligt materiale. På trods af dette var vi i stand til at detektere 2485 proteiner i 272 skeletale myofibre. Efter filtrering for mindst 1000 kvantificerede proteiner pr. fiber blev 250 fibre underkastet efterfølgende bioinformatisk analyse. Efter filtrering blev et gennemsnit på 1573 ± 359 proteiner pr. fiber kvantificeret (Supplerende Figur 10A, Supplerende Datasæt 17-18). Det er værd at bemærke, at proteomdybden af patientprøverne med nemalin myopati kun blev reduceret beskedent på trods af den signifikante reduktion i fiberstørrelse. Desuden gjorde behandlingen af disse data ved hjælp af vores egne FASTA-filer (inklusive ikke-kodende transkripter) det muligt for os at identificere fem mikrobielle proteiner i skeletale myofibre fra patienter med nemalin myopati (Supplerende datasæt 19). Proteomets dynamiske område var signifikant bredere, og det samlede antal proteiner i kontrolgruppen korrelerede godt med resultaterne af en tidligere 1000-fiber proteomanalyse (Supplerende figur 10B-C).
A. Mikroskopiske billeder, der viser fiberatrofi eller dystrofi og overvægten af forskellige fibertyper baseret på MYH i ACTA1- og TNNT1-nemaline myopatier (NM). Skalalinje = 100 μm. For at sikre reproducerbarhed af farvning hos ACTA1- og TNNT1-patienter blev tre patientbiopsier farvet to til tre gange (fire snit pr. tilfælde) før udvælgelse af repræsentative billeder. B. Fibertypeforhold hos deltagere baseret på MYH. C. Principal component analysis (PCA)-plot af skeletmuskelfibre hos patienter med nemaline myopatier og kontrolpersoner. D. Skeletmuskelfibre fra patienter med nemaline myopatier og kontrolpersoner projiceret på et PCA-plot bestemt ud fra de 1000 fibre analyseret i figur 2. For eksempel vulkanplot, der sammenligner forskelle mellem deltagere med ACTA1- og TNNT1-nemaline myopatier og kontrolpersoner, og mellem deltagere med ACTA1- og TNNT1-nemaline myopatier. Farvede cirkler angiver proteiner, der var signifikant forskellige ved π < 0,05, og mørke prikker angiver proteiner, der var signifikant forskellige ved FDR < 0,05. Statistisk analyse blev udført ved hjælp af Limma lineær modelmetode og empiriske Bayesianske metoder, efterfulgt af p-værdijustering for multiple sammenligninger ved hjælp af Benjamini-Hochberg-metoden. H. Berigelsesanalyse af signifikant differentielt udtrykte proteiner på tværs af hele proteomet og i type 1- og 2A-fibre. Statistisk analyse blev udført ved hjælp af clusterProfiler-pakken og Benjamini-Hochberg-justerede p-værdier. I, J. Principal component analysis (PCA) plots farvet efter ekstracellulær matrix og mitokondrielle genontologi (GO) termer.
Da nemaline myopatier kan påvirke andelen af MYH-udtrykkende myofibertyper i skeletmuskulatur,19,20 undersøgte vi først de MYH-udtrykkende myofibertyper hos patienter med nemaline myopatier og kontrolpersoner. Vi bestemte myofibertypen ved hjælp af en objektiv metode, der tidligere er beskrevet for 1000 myofiber-assayet (supplerende fig. 10D-E), og igen mislykkedes det os at identificere rene 2X myofibre (figur 6B). Vi observerede en heterogen effekt af nemaline myopatier på myofibertypen, da to patienter med ACTA1-mutationer havde en øget andel af type 1 myofibre, hvorimod to patienter med TNNT1 nemaline myopati havde en nedsat andel af type 1 myofibre (figur 6B). Faktisk var ekspressionen af MYH2 og hurtige troponin-isoformer (TNNC2, TNNI2 og TNNT3) nedsat i ACTA1-nemalin myopatier, hvorimod MYH7-ekspressionen var nedsat i TNNT1-nemalin myopatier (Supplerende Figur 11A). Dette er i overensstemmelse med tidligere rapporter om heterogen myofibertypeskift i nemalin myopatier.19,20 Vi bekræftede disse resultater ved immunhistokemi og fandt, at patienter med ACTA1-nemalin myopati havde en overvægt af type 1 myofibre, hvorimod patienter med TNNT1-nemalin myopati havde det modsatte mønster (Figur 6A).
På enkeltfiberproteomniveau klyngedes skeletmuskelfibre fra patienter med ACTA1- og TNNT1 nemalin myopati sig sammen med størstedelen af kontrolfibrene, hvor TNNT1 nemalin myopatifibre generelt var de hårdest påvirkede (Figur 6C). Dette var især tydeligt, når man plottede PCA-plot (principal component analysis) af pseudo-oppustede fibre for hver patient, hvor TNNT1 nemalin myopatipatienter 2 og 3 fremstod længst væk fra kontrolprøverne (Supplerende Figur 11B, Supplerende Datasæt 20). For bedre at forstå, hvordan fibre fra myopatipatienter sammenlignes med raske fibre, brugte vi detaljerede oplysninger opnået fra proteomisk analyse af 1.000 fibre fra raske voksne deltagere. Vi projicerede fibre fra myopatidatasættet (ACTA1- og TNNT1 nemalin myopatipatienter og kontrolpersoner) på PCA-plottet opnået fra den proteomiske analyse af 1000 fibre (Figur 6D). Fordelingen af MYH-fibertyper langs PC2 i kontrolfibrene svarede til den fiberfordeling, der blev opnået fra den proteomiske analyse af 1000 fibre. Imidlertid forskudte de fleste fibre hos patienter med nemalin myopati sig ned langs PC2 og overlappede med raske fibre med hurtige trækninger, uanset deres native MYH-fibertype. Selvom patienter med ACTA1 nemalin myopati viste et skift mod type 1-fibre, når de blev kvantificeret ved hjælp af MYH-baserede metoder, forskudte både ACTA1 nemalin myopati og TNNT1 nemalin myopati skeletmuskelfiberproteomet mod fibre med hurtige trækninger.
Vi sammenlignede derefter direkte hver patientgruppe med raske kontrolpersoner og identificerede henholdsvis 256 og 552 differentielt udtrykte proteiner i ACTA1- og TNNT1-nemalinmyopatier (Figur 6E-G og Supplerende Figur 11C, Supplerende Datasæt 21). Genberigelsesanalyse afslørede et koordineret fald i mitokondrielle proteiner (Figur 6H-I, Supplerende Datasæt 22). Overraskende nok var dette fald fuldstændig uafhængigt af den MYH-baserede fibertype, på trods af den differentielle overvægt af fibertyper i ACTA1- og TNNT1-nemalinmyopatier (Figur 6H og Supplerende Figur 11D-I, Supplerende Datasæt 23). Tre mikrobielle proteiner blev også reguleret i ACTA1- eller TNNT1-nemalinmyopatier. To af disse mikroproteiner, ENSG00000215483_TR14_ORF67 (også kendt som LINC00598 eller Lnc-FOXO1) og ENSG00000229425_TR25_ORF40 (lnc-NRIP1-2), viste kun differentiel forekomst i type 1-myofibre. Det er tidligere blevet rapporteret, at ENSG00000215483_TR14_ORF67 spiller en rolle i reguleringen af cellecyklus.56 På den anden side var ENSG00000232046_TR1_ORF437 (svarende til LINC01798) forhøjet i både type 1- og type 2A-myofibre i ACTA1-nemalin-myopati sammenlignet med raske kontrolpersoner (Supplerende Figur 12A, Supplerende Datasæt 24). I modsætning hertil var ribosomale proteiner stort set upåvirket af nemalin myopati, selvom RPS17 var nedreguleret i ACTA1 nemalin myopati (fig. 6E).
Berigelsesanalyse afslørede også opregulering af immunsystemprocesser i ACTA1- og TNNT1-nemalinmyopatier, mens celleadhæsion også var øget i TNNT1-nemalinmyopati (Figur 6H). Berigelsen af disse ekstracellulære faktorer blev afspejlet af de ekstracellulære matrixproteiner, der forskydte PCA i PC1 og PC2 i en negativ retning (dvs. mod de mest berørte fibre) (Figur 6J). Begge patientgrupper viste øget ekspression af ekstracellulære proteiner involveret i immunresponser og sarkolemmale reparationsmekanismer, såsom annexiner (ANXA1, ANXA2, ANXA5)57,58 og deres interagerende protein S100A1159 (Supplerende Figurer 12B-C). Denne proces er tidligere blevet rapporteret at være forstærket i muskeldystrofier60, men så vidt vi ved, er den ikke tidligere blevet forbundet med nemaline myopatier. Normal funktion af dette molekylære maskineri er nødvendig for sarkolemmal reparation efter skade og for fusion af nydannede myocytter med myofibre58,61. Den øgede aktivitet af denne proces i begge patientgrupper tyder således på en reparativ reaktion på skade forårsaget af myofiberinstabilitet.
Effekterne af hver nemalin myopati var godt korreleret (r = 0,736) og viste rimelig overlapning (Supplerende Figur 11A-B), hvilket indikerer, at ACTA1 og TNNT1 nemalin myopati har lignende effekter på proteomet. Nogle proteiner var dog kun reguleret i ACTA1 eller TNNT1 nemalin myopati (Supplerende Figur 11A og C). Det profibrotiske protein MFAP4 var et af de mest opregulerede proteiner i TNNT1 nemalin myopati, men forblev uændret i ACTA1 nemalin myopati. SKIC8, en komponent af PAF1C-komplekset, der er ansvarlig for regulering af HOX-gentranskription, var nedreguleret i TNNT1 nemalin myopati, men ikke påvirket i ACTA1 nemalin myopati (Supplerende Figur 11A). Direkte sammenligning af ACTA1- og TNNT1-nemalinmyopati afslørede større reduktioner i mitokondrieproteiner og stigninger i immunsystemproteiner i TNNT1-nemalinmyopati (Figur 6G-H og Supplerende Figur 11C og 11H-I). Disse data er i overensstemmelse med den større atrofi/dystrofi observeret i TNNT1-nemalinmyopati sammenlignet med TNNT1-nemalinmyopati (Figur 6A), hvilket tyder på, at TNNT1-nemalinmyopati repræsenterer en mere alvorlig form af sygdommen.
For at vurdere, om de observerede effekter af nemalin myopati fortsætter på hele muskelniveau, udførte vi en bulkproteomisk analyse af muskelbiopsier fra den samme kohorte af patienter med TNNT1 nemalin myopati og sammenlignede dem med kontrolpersoner (n = 3 pr. gruppe) (Supplerende figur 13A, Supplerende datasæt 25). Som forventet var kontrolpersonerne tæt beslægtede i principal component analysen, hvorimod patienter med TNNT1 nemalin myopati udviste højere intersample variation svarende til den, der ses i enkeltfiberanalyse (Supplerende figur 13B). Bulkanalyse reproducerede de differentielt udtrykte proteiner (Supplerende figur 13C, Supplerende datasæt 26) og biologiske processer (Supplerende figur 13D, Supplerende datasæt 27), der blev fremhævet ved at sammenligne individuelle fibre, men mistede evnen til at skelne mellem forskellige fibertyper og undlod at tage højde for heterogene sygdomseffekter på tværs af fibre.
Samlet set viser disse data, at proteomik med enkeltmyofiber kan belyse kliniske biologiske træk, der ikke kan detekteres ved målrettede metoder såsom immunoblotting. Desuden fremhæver disse data begrænsningerne ved at bruge aktinfibertypning (MYH) alene til at beskrive fænotypisk tilpasning. Selvom fibertypeskift varierer mellem aktin- og troponin-nemalinmyopatier, afkobler begge nemaline myopatier MYH-fibertypning fra skeletmuskelfibermetabolisme mod et hurtigere og mindre oxidativt muskelproteom.
Cellulær heterogenitet er afgørende for, at væv kan opfylde deres forskellige behov. I skeletmuskulatur beskrives dette ofte som fibertyper, der er karakteriseret ved forskellige grader af kraftproduktion og udtrættelighed. Det er dog klart, at dette kun forklarer en lille del af skeletmuskelfibervariabiliteten, som er meget mere variabel, kompleks og mangesidet end tidligere antaget. Teknologiske fremskridt har nu kastet lys over de faktorer, der regulerer skeletmuskelfibre. Faktisk tyder vores data på, at type 2X-fibre muligvis ikke er en særskilt skeletmuskelfibersubtype. Desuden identificerede vi metaboliske proteiner, ribosomale proteiner og celleassocierede proteiner som vigtige bestemmende faktorer for skeletmuskelfiberheterogenitet. Ved at anvende vores proteomiske arbejdsgang på patientprøver med nematodemyopati demonstrerede vi yderligere, at MYH-baseret fibertypning ikke fuldt ud afspejler skeletmuskelheterogenitet, især når systemet er forstyrret. Uanset den MYH-baserede fibertype resulterer nematodemyopati i et skift mod hurtigere og mindre oxidative fibre.
Skeletmuskelfibre er blevet klassificeret siden det 19. århundrede. Nyere omics-analyser har givet os mulighed for at begynde at forstå ekspressionsprofilerne for forskellige MYH-fibertyper og deres reaktioner på forskellige stimuli. Som beskrevet her har omics-tilgange også den fordel, at de er mere følsomme over for kvantificering af fibertypemarkører end traditionelle antistofbaserede metoder, uden at være afhængig af kvantificering af en enkelt (eller et par) markører for at definere en skeletmuskelfibertype. Vi brugte komplementære transkriptomiske og proteomiske arbejdsgange og integrerede resultaterne for at undersøge den transkriptionelle og post-transkriptionelle regulering af fiberheterogenitet i humane skeletmuskelfibre. Denne arbejdsgang resulterede i, at det ikke lykkedes at identificere rene 2X-type fibre på proteinniveau i vastus lateralis hos vores kohorte af raske unge mænd. Dette er i overensstemmelse med tidligere enkeltfiberstudier, der fandt <1% rene 2X-fibre i rask vastus lateralis, selvom dette bør bekræftes i andre muskler i fremtiden. Forskellen mellem detektionen af næsten rene 2X-fibre på mRNA-niveau og kun blandede 2A/2X-fibre på proteinniveau er forvirrende. MYH-isoformens mRNA-ekspression er ikke døgnrytmen,67 hvilket tyder på, at vi sandsynligvis ikke har "overset" MYH2-startsignalet i tilsyneladende rene 2X-fibre på RNA-niveau. En mulig forklaring, omend rent hypotetisk, kunne være forskelle i protein- og/eller mRNA-stabilitet mellem MYH-isoformer. Faktisk er ingen hurtig fiber 100 % ren for nogen MYH-isoform, og det er uklart, om MYH1 mRNA-ekspressionsniveauer i området 70-90 % ville resultere i lige stor MYH1- og MYH2-forekomst på proteinniveau. Når man overvejer hele transkriptomet eller proteomet, kan klyngeanalyse dog med sikkerhed kun identificere to forskellige klynger, der repræsenterer langsomme og hurtige skeletmuskelfibre, uanset deres præcise MYH-sammensætning. Dette er i overensstemmelse med analyser, der bruger transkriptomiske tilgange med én kerne, som typisk kun identificerer to forskellige myonukleære klynger. 68, 69, 70 Desuden, selvom tidligere proteomiske studier har identificeret type 2X-fibre, grupperes disse fibre ikke separat fra resten af de hurtige fibre og viser kun et lille antal differentielt rigelige proteiner sammenlignet med andre fibertyper baseret på MYH. 14 Disse resultater tyder på, at vi bør vende tilbage til det tidlige 20. århundredes syn på muskelfiberklassificering, som opdelte menneskelige skeletmuskelfibre ikke i tre forskellige klasser baseret på MYH, men i to klynger baseret på deres metaboliske og kontraktile egenskaber. 63
Endnu vigtigere er det, at myofiberheterogenitet bør overvejes på tværs af flere dimensioner. Tidligere "omics"-studier har peget i denne retning og antydet, at skeletmuskulaturfibre ikke danner diskrete klynger, men er arrangeret langs et kontinuum.11, 13, 14, 64, 71 Her viser vi, at ud over forskelle i skeletmuskulaturens kontraktile og metaboliske egenskaber kan myofibre differentieres ved hjælp af træk relateret til celle-celle-interaktioner og translationsmekanismer. Vi fandt faktisk ribosomheterogenitet i skeletmuskulaturfibre, der bidrager til heterogenitet uafhængigt af langsomme og hurtige fibertyper. Den underliggende årsag til denne betydelige myofiberheterogenitet, uafhængigt af langsomme og hurtige fibertyper, forbliver uklar, men den kan pege på specialiseret rumlig organisering inden for muskelfascikler, der optimalt reagerer på specifikke kræfter og belastninger,72 specialiseret cellulær eller organspecifik kommunikation med andre celletyper i muskelmikromiljøet73,74,75 eller forskelle i ribosomaktivitet inden for individuelle myofibre. Faktisk har ribosomal heteroplasmi, enten gennem paralog substitution af RPL3 og RPL3L eller på niveauet af 2'O-methylering af rRNA, vist sig at være associeret med skeletmuskulaturhypertrofi76,77. Multiomiske og rumlige anvendelser kombineret med funktionel karakterisering af individuelle myofibre vil yderligere fremme vores forståelse af muskelbiologi på det multiomiske niveau78.
Ved at analysere proteomerne fra enkelte myofibre fra patienter med nemaline myopatier demonstrerede vi også anvendeligheden, effektiviteten og anvendeligheden af enkeltmyofiberproteomik til at belyse den kliniske patofysiologi af skeletmuskulatur. Ved at sammenligne vores arbejdsgang med global proteomisk analyse var vi desuden i stand til at demonstrere, at enkeltmyofiberproteomik giver den samme informationsdybde som global vævsproteomik og udvider denne dybde ved at tage højde for interfiberheterogenitet og myofibertype. Ud over de forventede (omend variable) forskelle i fibertypeforholdet observeret i ACTA1- og TNNT1 nemaline myopatier sammenlignet med raske kontrolpersoner,19 observerede vi også oxidativ og ekstracellulær remodellering uafhængigt af MYH-medieret fibertypeskift. Fibrose er tidligere blevet rapporteret i TNNT1 nemaline myopatier.19 Vores analyse bygger dog videre på dette fund ved også at afsløre øgede niveauer af ekstracellulære sekreterede stressrelaterede proteiner, såsom annexiner, involveret i sarkolemmale reparationsmekanismer, i myofibre fra patienter med ACTA1- og TNNT1 nemaline myopatier.57,58,59 Afslutningsvis kan øgede annexinniveauer i myofibre fra patienter med nemaline myopati repræsentere et cellulært respons på reparation af alvorligt atrofiske myofibre.
Selvom denne undersøgelse repræsenterer den største analyse af hele muskelomics af mennesker på tværs af enkeltfibre til dato, er den ikke uden begrænsninger. Vi isolerede skeletmuskelfibre fra en relativt lille og homogen stikprøve af deltagere og en enkelt muskel (vastus lateralis). Derfor er det umuligt at udelukke eksistensen af specifikke fiberpopulationer på tværs af muskeltyper og i ekstremer af muskelfysiologi. For eksempel kan vi ikke udelukke muligheden for, at en delmængde af ultrahurtige fibre (f.eks. rene 2X-fibre) opstår hos højt trænede sprintere og/eller styrketræningsatleter79 eller i perioder med muskelinaktivitet66,80. Desuden forhindrede den begrænsede stikprøvestørrelse af deltagere os i at undersøge kønsforskelle i fiberheterogenitet, da fibertypeforhold vides at variere mellem mænd og kvinder. Desuden var vi ikke i stand til at udføre transkriptomiske og proteomiske analyser på de samme muskelfibre eller prøver fra de samme deltagere. I takt med at vi og andre fortsætter med at optimere analyser af enkeltceller og enkeltmyofibre ved hjælp af omics-analyse for at opnå ultra-lavt prøveinput (som demonstreret her i analysen af fibre fra patienter med mitokondriel myopati), bliver muligheden for at kombinere multi-omics (og funktionelle) tilgange inden for enkeltmuskelfibre tydelig.
Samlet set identificerer og forklarer vores data transkriptionelle og posttranskriptionelle drivkræfter bag heterogenitet i skeletmuskulaturen. Specifikt præsenterer vi data, der udfordrer et langvarigt dogme inden for skeletmuskulaturfysiologi forbundet med den klassiske MYH-baserede definition af fibertyper. Vi håber at kunne forny debatten og i sidste ende gentænke vores forståelse af klassificering og heterogenitet af skeletmuskulaturfibre.
Fjorten kaukasiske deltagere (12 mænd og 2 kvinder) indvilligede frivilligt i at deltage i dette studie. Studiet blev godkendt af den etiske komité på Ghent Universitetshospital (BC-10237), overholdt Helsinki-erklæringen fra 2013 og blev registreret på ClinicalTrials.gov (NCT05131555). Deltagernes generelle karakteristika er præsenteret i supplerende tabel 1. Efter at have indhentet mundtligt og skriftligt informeret samtykke, gennemgik deltagerne en lægeundersøgelse før endelig inkludering i studiet. Deltagerne var unge (22-42 år), raske (ingen medicinske tilstande, ingen rygehistorie) og moderat fysisk aktive. Maksimal iltoptagelse blev bestemt ved hjælp af en step ergometer til vurdering af fysisk kondition som tidligere beskrevet. 81
Muskelbiopsiprøver blev indsamlet i hvile og faste tre gange med 14 dages mellemrum. Da disse prøver blev indsamlet som en del af et større studie, indtog deltagerne placebo (laktose), en H1-receptorantagonist (540 mg fexofenadin) eller en H2-receptorantagonist (40 mg famotidin) 40 minutter før biopsien. Vi har tidligere vist, at disse histaminreceptorantagonister ikke påvirker hvilende skeletmuskulaturs kondition81, og der blev ikke observeret nogen tilstandsrelateret klyngedannelse i vores kvalitetskontrolplots (Supplerende Figur 3 og 6). En standardiseret kost (41,4 kcal/kg kropsvægt, 5,1 g/kg kropsvægt kulhydrat, 1,4 g/kg kropsvægt protein og 1,6 g/kg kropsvægt fedt) blev opretholdt i 48 timer før hver forsøgsdag, og en standardiseret morgenmad (1,5 g/kg kropsvægt kulhydrat) blev indtaget om morgenen på forsøgsdagen. Under lokalbedøvelse (0,5 ml 1% lidokain uden adrenalin) blev der taget muskelbiopsier fra vastus lateralis-musklen ved hjælp af perkutan Bergström-aspiration.82 Muskelprøver blev straks indlejret i RNAlater og opbevaret ved 4°C indtil manuel fiberdissektion (op til 3 dage).
Frisk isolerede myofiberbundter blev overført til frisk RNAlater-medium i en dyrkningsskål. Individuelle myofibre blev derefter manuelt dissekeret ved hjælp af et stereomikroskop og en fin pincet. 25 fibre blev dissekeret fra hver biopsi, med særlig vægt på at udvælge fibre fra forskellige områder af biopsien. Efter dissektion blev hver fiber forsigtigt nedsænket i 3 μl lysisbuffer (SingleShot Cell Lysis Kit, Bio-Rad) indeholdende proteinase K og DNase-enzymer for at fjerne uønskede proteiner og DNA. Cellelyse og fjernelse af protein/DNA blev derefter initieret ved kort vortexning, centrifugering af væsken i en mikrocentrifuge og inkubation ved stuetemperatur (10 min). Lysatet blev derefter inkuberet i en termisk cykler (T100, Bio-Rad) ved 37°C i 5 min, 75°C i 5 min og derefter straks opbevaret ved -80°C indtil videre behandling.
Illumina-kompatible polyadenylerede RNA-biblioteker blev fremstillet ud fra 2 µl myofiberlysat ved hjælp af QuantSeq-Pool 3′ mRNA-Seq Library Prep Kit (Lexogen). Detaljerede metoder kan findes i producentens manual. Processen begynder med første-strengs cDNA-syntese ved revers transkription, hvor unikke molekylære identifikatorer (UMI'er) og prøvespecifikke i1-stregkoder introduceres for at sikre pooling af prøver og reducere teknisk variation under downstream-behandling. cDNA fra 96 myofibre pooles derefter og oprenses med magnetiske perler, hvorefter RNA fjernes, og anden-strengssyntese udføres ved hjælp af tilfældige primere. Biblioteket oprenses med magnetiske perler, poolspecifikke i5/i7-tags tilføjes, og PCR-amplificeres. Et sidste oprensningstrin producerer Illumina-kompatible biblioteker. Kvaliteten af hver bibliotekspool blev vurderet ved hjælp af High Sensitivity Small Fragment DNA Analysis Kit (Agilent Technologies, DNF-477-0500).
Baseret på Qubit-kvantificering blev pools yderligere poolet ved ækvimolære koncentrationer (2 nM). Den resulterende pool blev derefter sekventeret på et NovaSeq 6000-instrument i standardtilstand ved hjælp af NovaSeq S2 Reagent Kit (1 × 100 nukleotider) med 2 nM belastning (4% PhiX).
Vores pipeline er baseret på Lexogens QuantSeq Pool dataanalysepipeline (https://github.com/Lexogen-Tools/quantseqpool_analysis). Data blev først demultiplekset med bcl2fastq2 (v2.20.0) baseret på i7/i5-indekset. Read 2 blev derefter demultiplekset med idemux (v0.1.6) baseret på i1-prøvestregkoden, og UMI-sekvenser blev ekstraheret med umi_tools (v1.0.1). Reads blev derefter trimmet med cutadapt (v3.4) i flere runder for at fjerne korte reads (<20 i længden) eller reads, der udelukkende bestod af adaptersekvenser. Reads blev derefter justeret til det humane genom ved hjælp af STAR (v2.6.0c), og BAM-filer blev indekseret med SAMtools (v1.11). Duplikerede reads blev fjernet ved hjælp af umi_tools (v1.0.1). Endelig blev alignment-tælling udført ved hjælp af featureCounts i Subread (v2.0.3). Kvalitetskontrol blev udført ved hjælp af FastQC (v0.11.9) på flere mellemliggende stadier af pipelinen.
Al yderligere bioinformatisk behandling og visualisering blev udført i R (v4.2.3), primært ved hjælp af Seurat (v4.4.0)-arbejdsgangen.83 Derfor blev individuelle UMI-værdier og metadatamatricer transformeret til Seurat-objekter. Gener udtrykt i mindre end 30% af alle fibre blev fjernet. Prøver af lav kvalitet blev fjernet baseret på en minimumstærskel på 1000 UMI-værdier og 1000 detekterede gener. I sidste ende bestod 925 fibre alle kvalitetskontrolfiltreringstrin. UMI-værdier blev normaliseret ved hjælp af Seurat SCTransform v2-metoden,84 inklusive alle 7418 detekterede funktioner, og forskelle mellem deltagerne blev regresseret væk. Alle relevante metadata kan findes i Supplerende Datasæt 28.
Opslagstidspunkt: 10. september 2025