Tak fordi du besøgte Nature.com. Den version af browser, du bruger, har begrænset CSS -support. For de bedste resultater anbefaler vi, at du bruger en nyere version af din browser (eller deaktiverer kompatibilitetstilstand i Internet Explorer). I mellemtiden, for at sikre løbende støtte, viser vi stedet uden styling eller JavaScript.
Mikrobiel vækst i sår manifesterer sig ofte som biofilmer, der forstyrrer heling og er vanskelige at udrydde. Nye sølvdressinger hævder at bekæmpe sårinfektioner, men deres antibiofilmeffektivitet og infektionsuafhængige helingseffekter er generelt ukendt. Ved anvendelse af in vitro og in vivo biofilmmodeller af Staphylococcus aureus og Pseudomonas aeruginosa rapporterer vi effektiviteten af Ag1+ ion-genererende forbindinger; AG1+ forbindinger indeholdende ethylendiaminetetraeddikesyre og benzethoniumchlorid (AG1+/EDTA/BC) og forbindinger indeholdende sølvnitrat (Ag Oxysalts). , der producerer Ag1+, Ag2+ og Ag3+ ioner til bekæmpelse af sårbiofilm og dens virkning på heling. AG1+ forbindinger havde minimale effekter på sårbiofilm in vitro og i mus (C57BL/6J). I modsætning hertil reducerede oxygenerede Ag -salte og Ag1+/EDTA/BC -forbindinger signifikant antallet af levedygtige bakterier i biofilmer in vitro og demonstrerede en signifikant reduktion i bakterielle og EPS -komponenter i musens sårbiofilmer. Disse forbindinger havde forskellige effekter på helingen af biofilm-inficerede og ikke-biofilm-inficerede sår, med iltede saltdressinger med mere fordelagtige virkninger på reepitelialisering, sårstørrelse og betændelse sammenlignet med kontrolbehandlinger og andre sølvdressinger. De forskellige fysisk-kemiske egenskaber ved sølvdressinger kan have forskellige effekter på sårbiofilm og heling, og dette skal overvejes, når man vælger en forbinding til behandling af biofilm-inficerede sår.
Kroniske sår defineres som ”sår, der ikke klarer sig gennem de normale stadier af heling på en ordnet og rettidig måde” 1. Kroniske sår skaber en psykologisk, social og økonomisk byrde for patienter og sundhedsvæsenet. De årlige NHS -udgifter til behandling af sår og tilknyttede komorbiditeter anslås til £ 8,3 milliarder i 2017–182. Kroniske sår er også i øjeblikket et presserende problem i USA, hvor Medicare estimerer de årlige omkostninger til behandling af patienter med sår til $ 28,1– $ 96,8 milliarder3.
Infektion er en vigtig faktor, der forhindrer sårheling. Infektioner manifesterer sig ofte som biofilmer, der er til stede i 78% af ikke-helende kroniske sår. Biofilmer dannes, når mikroorganismer bliver irreversibelt fastgjort til overflader, såsom såroverflader, og kan aggregeres for at danne ekstracellulær polymer (EPS) -producerende samfund. Sårbiofilm er forbundet med en øget inflammatorisk respons, der fører til vævsskade, som kan forsinke eller forhindre heling4. Stigningen i vævsskade kan delvis skyldes øget aktivitet af matrixmetalloproteinaser, kollagenase, elastase og reaktive iltarter5. Derudover er inflammatoriske celler og biofilmer i sig selv høje forbrugere af ilt og kan derfor forårsage lokal vævshypoxi, der udtømmer celler af det vitale ilt, der er nødvendigt til effektiv vævsreparation6.
Modne biofilmer er meget resistente over for antimikrobielle midler, hvilket kræver aggressive strategier til at kontrollere biofilminfektioner, såsom mekanisk behandling efterfulgt af effektiv antimikrobiel behandling. Fordi biofilmer hurtigt kan regenerere, kan effektive antimikrobielle stoffer reducere risikoen for reformation efter kirurgisk debridement7.
Sølv bruges i stigende grad i antimikrobielle forbindinger og bruges ofte som en førstelinjebehandling til kroniske inficerede sår. Der er mange kommercielt tilgængelige sølvdressinger, der hver indeholder en anden sølvkomposition, koncentration og basismatrix. Fremskridt inden for sølvarmbånd har ført til udviklingen af nye sølvarmbånd. Den metalliske form for sølv (AG0) er inert; For at opnå antimikrobiel effektivitet skal den miste et elektron for at danne ionisk sølv (AG1+). Traditionelle sølvdressinger indeholder sølvforbindelser eller metallisk sølv, som, når de udsættes for væske, nedbrydes til dannelse af AG1+ -ioner. Disse AG1+ -ioner reagerer med bakteriecellen og fjerner elektroner fra strukturelle komponenter eller kritiske processer, der er nødvendige for at overleve. Patenteret teknologi har ført til udviklingen af en ny sølvforbindelse, Ag Oxysalts (sølvnitrat, AG7NO11), som er inkluderet i sårforbindinger. I modsætning til traditionelt sølv producerer nedbrydningen af iltholdige salte tilstande med sølv med højere valens (AG1+, AG2+og AG3+). In vitro -undersøgelser har vist, at lave koncentrationer af oxygenerede sølvsalte er mere effektive end enkelt ionsølv (AG1+) mod patogene bakterier, såsom Pseudomonas aeruginosa, Staphylococcus aureus og Escherichia coli8,9. En anden ny type sølvdressing inkluderer yderligere ingredienser, nemlig ethylendiaminetetraeddikesyre (EDTA) og benzethoniumchlorid (BC), som rapporteres at målrette biofilm EPS og derved øge sølvets penetration til biofilmen. Disse nye sølvteknologier tilbyder nye måder at målrette sårbiofilmer på. Imidlertid er virkningen af disse antimikrobielle stoffer på sårmiljøet og infektionsuafhængig heling vigtig for at sikre, at de ikke skaber et ugunstigt sårmiljø eller forsinker helbredelse. Der er rapporteret om bekymring over in vitro sølvcytotoksicitet med flere sølvdressinger10,11. Imidlertid har cytotoksicitet i vitro imidlertid endnu ikke oversat til in vivo -toksicitet, og flere AG1+ -klædninger har vist en god sikkerhedsprofil12.
Her undersøgte vi effektiviteten af carboxymethylcellulose -forbindinger indeholdende nye sølvformuleringer mod sårbiofilm in vitro og in vivo. Derudover blev virkningerne af disse forbindinger på immunresponser og helbredelse uafhængigt af infektion vurderet.
Alle anvendte forbindinger var kommercielt tilgængelige. 3M Kerracel Gel Fiber Dressing (3M, Knutsford, UK) er en ikke-antimikrobiel 100% carboxymethylcellulose (CMC) gelfiberforbinding, der blev brugt som kontroldressing i denne undersøgelse. Tre antimikrobielle CMC -sølvdressinger blev evalueret, nemlig 3M Kerracel AG -dressing (3M, Knutsford, UK), der indeholder 1,7 vægt%. Oxygeneret sølvsalt (AG7NO11) i højere valenssølvioner (AG1+, AG2+og AG3+). Under nedbrydningen af Ag7NO11 dannes Ag1+, Ag2+ og Ag3+ -ioner i et forhold på 1: 2: 4. Aquacel AG Extra dressing indeholdende 1,2% sølvchlorid (AG1+) (Convatec, Deeside, UK) 13 og Aquacel AG+Extra Dressing indeholdende 1,2% sølvchlorid (AG1+), EDTA og Benzethonium chlorid (Convatec, Deeside, UK) 14.
De stammer, der blev anvendt i denne undersøgelse, var Pseudomonas aeruginosa NCTC 10781 (Public Health England, Salisbury) og Staphylococcus aureus NCTC 6571 (Public Health England, Salisbury).
Bakterier blev dyrket natten over i Muller-Hinton-bouillon (Oxoid, Altrincham, UK). Kulturen natten over blev derefter fortyndet 1: 100 i Mueller-Hinton-bouillon og 200 ul belagt på steril 0,2 um Whatman Cyclopore Membranes (Whatman Plc, Maidstone, UK) på Mueller-Hinton Agar-plader (Sigma-Aldrich Company Ltd, Kent, Great Britain ). ) Kolonial biofilmdannelse ved 37 ° C i 24 timer. Disse koloniale biofilmer blev testet for logaritmisk krympning.
Skær forbindingen i 3 cm2 kvadratiske stykker og præ-fugtighed med sterilt deioniseret vand. Placer bandagen over biofilmen i kolonien på agarpladen. Hver 24 ha biofilm blev fjernet, og levedygtige bakterier inden for biofilmen (CFU/ml) blev kvantificeret ved seriel fortynding (10-1 til 10-7) i dagvinkelneutraliseringsbuljong (Merck-Millipore). Efter 24 timers inkubation ved 37 ° C blev standardpladetællinger udført på Mueller-Hinton Agar-plader. Hvert behandlings- og tidspunkt blev udført i tre eksemplarer, og pladetællinger blev gentaget for hver fortynding.
Svinekød mavehud opnås fra kvindelige store hvide svin inden for 15 minutter efter slagtning i overensstemmelse med EU -eksportstandarderne. Huden blev barberet og renset med alkoholservietter og frosset derefter ved -80 ° C i 24 timer for at devitalisere huden. Efter optøning blev 1 cm2 hudstykker vasket tre gange med PBS, 0,6% natriumhypochlorit og 70% ethanol i 20 minutter hver gang. Før du fjerner epidermis, skal du fjerne enhver resterende ethanol ved at vaske 3 gange i steril PBS. Huden blev dyrket i en 6-brønds plade med en 0,45 um tyk nylonmembran (Merck-Millipore) på toppen og 3 absorberende puder (Merck-Millipore) indeholdende 3 ml føtal bovint serum (Sigma) suppleret med 10% Dulbeccos modificerede Ørn. Medium (Dulbeccos modificerede Eagle Medium - Aldrich Ltd.).
Koloniale biofilmer blev dyrket som beskrevet til eksponeringsundersøgelser af biofilm. Efter dyrkning af biofilmen på membranen i 72 timer blev biofilmen påført på hudoverfladen under anvendelse af en steril inokulationssløjfe, og membranen blev fjernet. Biofilmen blev derefter inkuberet på grisens dermis i yderligere 24 timer ved 37 ° C for at lade biofilmen modnes og klæber til grisens hud. Efter at biofilmen var modnet og fastgjort, blev en 1,5 cm2 forbinding, forudfustet med sterilt destilleret vand, påført direkte på hudoverfladen og inkuberet ved 37 ° C i 24 timer. Levedygtige bakterier blev visualiseret ved farvning ved ensartet anvendelse af prestoblue -celleviabilitetsreagens (Invitrogen, Life Technologies, Paisley, UK) på den apikale overflade af hver eksplant og inkubering af den i 5 minutter. Brug Leica DFC425 digitalt kamera til øjeblikkeligt at fange billeder på Leica MZ8 -mikroskopet. Områder farvet lyserød blev kvantificeret ved hjælp af Image Pro-software version 10 (Media Cybernetics Inc, Rockville, MD Image-Pro (MediaCy.com)). Scanning af elektronmikroskopi blev udført som beskrevet nedenfor.
Bakterier dyrket natten over blev fortyndet 1: 100 i Mueller-Hinton-bouillon. 200 μl kultur blev tilsat til steril 0,2 um Whatman Cyclopore Membrane (Whatman, Maidstone, UK) og udpladet på Mueller-Hinton Agar. Biofilmplader blev inkuberet ved 37 ° C i 72 timer for at muliggøre moden biofilmdannelse.
Efter 3 dages biofilmmodning blev en 3 cm2 firkantet bandage placeret direkte på biofilmen og inkuberet ved 37 ° C i 24 timer. Efter fjernelse af bandagen fra biofilmoverfladen blev 1 ml prestoblue -celleviabilitetsreagens (Invitrogen, Waltham, MA) tilsat til overfladen af hver biofilm i 20 sekunder. Overfladerne blev tørret, før farveændringer blev registreret ved hjælp af et Nikon D2300 digitalt kamera (Nikon UK Ltd., Kingston, UK).
Forbered kulturer natten over på Mueller-Hinton-agar, overfør individuelle kolonier til 10 ml Mueller-Hinton-bouillon og inkuber på en ryster ved 37 ° C (100 o / min). Efter inkubation natten over blev kulturen fortyndet 1: 100 i Mueller-Hinton-bouillon, og 300 µl blev opdaget på 0,2 um cirkulær Whatman Cyclopore Membrane (Whatman International, Maidstone, UK) på Mueller-Hinton Agar og inkuberet ved 37 ° C inden for 72 timer . . Den modne biofilm blev påført såret som beskrevet nedenfor.
Alt arbejde med dyr blev udført på University of Manchester under en projektlicens godkendt af Office of Animal Welfare and Ethical Review (P8721BD27) og i overensstemmelse med retningslinjer offentliggjort af hjemmekontoret under 2012 Revised ASPA. Alle forfattere overholdt ankomstretningslinjerne. Otte uger gamle C57BL/6J-mus (Envigo, Oxon, UK) blev anvendt til alle in vivo-studier. Mus blev bedøvet med isofluran (Piramal Critical Care Ltd, West Drayton, UK), og deres rygoverflader blev barberet og renset. Hver mus fik derefter et 2 × 6 mm excisionalt sår under anvendelse af en Stiefel Biopsy Punch (Schuco International, Hertfordshire, UK). For biofilm-inficerede sår, påføres 72-timers kolonialbiofilm dyrket på membranen som beskrevet ovenfor til det dermale lag af såret ved anvendelse af en steril inokulationssløjfe umiddelbart efter skade og kasser membranen. En kvadratcentimeter påklædning er forudfustet med sterilt vand for at opretholde et fugtigt sårmiljø. Påklædninger blev påført direkte på hvert sår og dækket med 3 m tegaderm -film (3m, Bracknell, UK) og Mastisol Liquid Alhesive (veltalet sundhedsvæsen, Ferndale, MI) påført omkring kanterne for at tilvejebringe yderligere klæbemiddel. Buprenorphin (Animalcare, York, UK) blev administreret i en koncentration på 0,1 mg/kg som et smertestillende middel. CULL MICE tre dage efter skade ved hjælp af skema 1 -metoden og fjern, halver og opbevar sårområdet efter behov.
Hematoxylin (termofisher videnskabelig) og eosin (termofisher videnskabelig) farvning blev udført i henhold til producentens protokol. Sårområde og reepitelialisering blev kvantificeret ved hjælp af Image Pro -software version 10 (Media Cybernetics Inc, Rockville, MD).
Vævsektioner blev afvokset i xylen (Thermofisher Scientific, Loughborough, UK), rehydreret med 100-50% graderet ethanol og kort nedsænket i deioniseret vand (termofisher videnskabelig). Immunohistokemi blev udført under anvendelse af Vectastain Elite ABC PK-6104 Kit (Vector Laboratories, Burlingame, CA) i henhold til producentens protokol. Primære antistoffer mod neutrofiler NIMP-R14 (Thermofisher Scientific) og makrofager MS CD107B Pure M3/84 (BD Biosciences, Wokingham, UK) blev fortyndet 1: 100 i blokeringsopløsning og tilføjet til den afskårne overflade, efterfulgt af 2 antistoffer Anti-, Vectastainain ABC og Vector Nova Red Peroxidase (HRP) substratsæt (Vector Laboratories, Burlingame, CA) og forsænket med hæmatoxylin. Billeder blev erhvervet ved hjælp af et Olympus BX43-mikroskop og et Olympus DP73 digitalt kamera (Olympus, Southend-on-Sea, UK).
Hudprøver blev fikseret i 2,5% glutaraldehyd og 4% formaldehyd i 0,1 M Hepes (pH 7,4) i 24 timer ved 4 ° C. Prøver blev dehydreret under anvendelse af graderet ethanol og tørret i CO2 under anvendelse af et Quorum K850 kritisk punkttørrer (Quorum Technologies Ltd, Loughton, UK) og sputter coatet med guld-palladiumlegering ved hjælp af en Quorum SC7620 Mini Sputterer/Glow Deplad System. Prøver blev afbildet under anvendelse af et Fei Quanta 250 -scanningselektronmikroskop (Thermofisher Scientific) for at visualisere sårets centrale punkt.
TOTO-1 iodid (2 um) blev påført den udskårne musesåroverflade og inkuberet i 5 minutter ved 37 ° C (termofisher videnskabelig) og behandlet med SYTO-60 (10 um) ved 37 ° C (termofisher videnskabelig). 15-minutters Z-Stack-billeder blev oprettet ved hjælp af en Leica TCS SP8.
Biologiske og tekniske replikatdata blev tabuleret og analyseret ved hjælp af GraphPad Prism V9 -software (GraphPad Software, La Jolla, CA). Envejs variansanalyse med flere sammenligninger ved hjælp af Dunnett's post hoc-test blev anvendt til at teste for forskelle mellem hver behandling og den ikke-antimikrobielle kontroldressing. En P -værdi <0,05 blev betragtet som signifikant.
Effektiviteten af sølvgelfibrøse forbindinger blev først vurderet mod biofilmkolonier af Staphylococcus aureus og Pseudomonas aeruginosa in vitro. Sølvdressinger indeholder forskellige formler af sølv: traditionelle sølvdressinger producerer AG1+ -ioner; Sølvdressinger, der kan producere AG1+ -ioner efter tilsætning af EDTA/BC, kan ødelægge biofilmmatrixen og udsætte bakterier for sølv under den antibakterielle virkning af sølv. ioner15 og forbindinger indeholdende oxygenerede Ag -salte, der producerer Ag1+, Ag2+ og Ag3+ ioner. Dens effektivitet blev sammenlignet med en ikke-antimikrobiel kontrolforbinding lavet af gelede fibre. Resterende levedygtige bakterier i biofilmen blev vurderet hver 24 timer i 8 dage (figur 1). På dag 5 blev biofilmen genokuleret med 3,85 × 105s. Staphylococcus aureus eller 1,22 × 105p. aeruginosa for at vurdere biofilmgenvinding. Sammenlignet med ikke-antimikrobielle kontrolforbindinger havde AG1+ -klædninger minimal effekt på bakteriel levedygtighed i Staphylococcus aureus og Pseudomonas aeruginosa biofilmer over 5 dage. I modsætning hertil var forbindinger, der indeholdt oxygeneret Ag og Ag1 + + EDTA/BC -salte, effektive til at dræbe bakterier inden for biofilmen inden for 5 dage. Efter gentagen inokulation med planktoniske bakterier på dag 5 blev der ikke observeret nogen restaurering af biofilmen (fig. 1).
Kvantificering af levedygtige bakterier i Staphylococcus aureus og Pseudomonas aeruginosa biofilmer efter behandling med sølvdressinger. Biofilmkolonier af Staphylococcus aureus og Pseudomonas aeruginosa blev behandlet med sølvdressinger eller ikke-antimikrobielle kontrolforbindinger, og antallet af levedygtige bakterier blev bestemt hver 24. time. Efter 5 dage blev biofilmen genokuleret med 3,85 × 105s. Staphylococcus aureus eller 1,22 × 105p. Kolonier af bakterioplankton Pseudomonas aeruginosa blev dannet individuelt for at vurdere biofilmgenvinding. Grafer viser gennemsnit +/- standardfejl.
For at visualisere effekten af sølvdressinger på biofilm levedygtighed blev forbindinger påført til modne biofilmer dyrket på porcine hud ex vivo. Efter 24 timer fjernes forbindingen, og biofilmen er farvet med et blåt reaktivt farvestof, der metaboliseres af levende bakterier til en lyserød farve. Biofilmer behandlet med kontroldressinger var lyserøde, hvilket indikerede tilstedeværelsen af levedygtige bakterier inden for biofilmen (figur 2A). I modsætning hertil var biofilmen, der blev behandlet med Ag Oxysols -dressing, primært blå, hvilket indikerede, at de resterende bakterier på overfladen af svinens hud var ikke -levedygtige bakterier (figur 2B). Blandet blå og lyserød farve blev observeret i biofilmer behandlet med AG1+ -holdige forbindinger, hvilket indikerer tilstedeværelsen af levedygtige og ikke-levedygtige bakterier i biofilmen (figur 2C), hvorimod EDTA/BC-forbindinger indeholdende AG1+ var overvejende blå med nogle lyserøde pletter. indikerer områder, der ikke er påvirket af sølvdressingen (figur 2D). Kvantificering af aktive (lyserøde) og inaktive (blå) områder viste, at kontrolplasteret var 75% aktiv (figur 2E). AG1 + + EDTA/BC -forbindinger udførte på samme måde som iltede Ag Salt -forbindinger med overlevelsesrater på henholdsvis 13% og 14%. AG1+ -klædningen reducerede også bakteriel levedygtighed med 21%. Disse biofilmer blev derefter observeret under anvendelse af scanningselektronmikroskopi (SEM). Efter behandling med kontrolforbindelsen og AG1+ -klædningen blev der observeret et lag af Pseudomonas aeruginosa, der dækkede den porcinehud (figur 2F, H), hvorimod blev der efter behandling med AG1+ dressing fundet få bakterieceller fundet og få bakterieceller blev fundet under. Kollagenfibre kan betragtes som vævsstrukturen af porcine hud (figur 2G). Efter behandling med AG1 + + EDTA/BC -forbinding var bakterieplaques og underliggende kollagenfiberplaques synlige (figur 2i).
Visualisering af Pseudomonas aeruginosa biofilm efter sølvdressing behandling. (A-D) Bakteriel levedygtighed i Pseudomonas aeruginosa-biofilm dyrket på porcine hud blev visualiseret ved hjælp af prestoblue levedygtighed farvestof 24 timer efter behandling med sølvdressinger eller ikke-antimikrobielle kontrolforbindinger. Levende bakterier er lyserøde, ikke-levedygtige bakterier og svineskind er blå. (E) Kvantificering af Pseudomonas aeruginosa biofilmer dyrket på porcin hud (lyserød plet) ved hjælp af scanningselektronmikroskopi-billedpro version 10 (FI) og behandlet med en sølvforbinding eller en ikke-antimikrobiel kontrolforbinding i 24 timer. SEM Scale Bar = 5 um. (J - M) Colonial Biofilms voksede på filtre og blev farvet med prestoblue -reaktivt farvestof efter 24 timers inkubation med sølvdressinger.
For at bestemme, om tæt kontakt mellem forbindingerne og biofilmene påvirkede effektiviteten af forbindingerne, blev koloniale biofilmer placeret på en plan overflade behandlet med forbindingerne i 24 timer og derefter farvet med reaktive farvestoffer. Den ubehandlede biofilm var mørkosa i farve (figur 2J). I modsætning til biofilmer behandlet med forbindinger indeholdende iltede Ag -salte (figur 2K) viste biofilmer behandlet med forbindinger indeholdende AG1+ eller Ag1++ EDTA/BC bånd af lyserød farvning (figur 2L, M). Denne lyserøde farve indikerer tilstedeværelsen af levedygtige bakterier og er forbundet med suturområdet inden for forbindingen. Disse syede områder skaber døde rum, der gør det muligt for bakterier i biofilmen at overleve.
For at evaluere effektiviteten af sølvdressinger in vivo blev fuld tykkelse, der skød sår af mus inficeret med modne S. aureus og P. aeruginosa biofilmer, behandlet med ikke-antimikrobielle kontrolforbindinger eller sølvdressinger. Efter 3 dages behandling viste makroskopisk billedanalyse mindre sårstørrelser, når de blev behandlet med oxygenerede saltdressinger sammenlignet med ikke-antimikrobielle kontrolforbindinger og andre sølvdressinger (figur 3A-H). For at bekræfte disse observationer blev sår høstet, og sårområdet, og reepithelialisering blev kvantificeret på hæmatoxylin og eosinfarvede vævssektioner under anvendelse af Image Pro-software version 10 (figur 3I-L).
Effekten af sølvdressinger på såroverfladen og genepitelisering af sår inficeret med biofilmer. (A - H) Små celler inficeret med biofilmer af Pseudomonas aeruginosa (A - D) og Staphylococcus aureus (E - H) efter tre dages behandling med en ikke -antimikrobiel kontroldressing, en iltet Ag Salt dressing, en AG1+ dressing og en Ag1+ forbinding. Repræsentative makroskopiske billeder. Sår af mus med AG1 + + EDTA/BC dressing. (IL) Repræsentant Pseudomonas aeruginosa -infektion, histologiske sektioner farvet med hæmatoxylin og eosin, der bruges til at kvantificere sårområdet og epitelial regenerering. Kvantificering af sårområdet (M, O) og procentvis reepitelisering (N, P) af sår inficeret med Pseudomonas aeruginosa (M, N) og Staphylococcus aureus (O, P) Biofilms (pr. Behandlingsgruppe N = 12). Grafer viser gennemsnit +/- standardfejl. * betyder p = <0,05 ** betyder p = <0,01; Makroskopisk skala = 2,5 mm, histologisk skala = 500 um.
Kvantificering af sårområdet i sår inficeret med Pseudomonas aeruginosa biofilm (figur 3M) viste, at sår behandlet med Ag Oxysalts havde en gennemsnitlig sårstørrelse på 2,5 mm2, mens den ikke-antimikrobielle kontrolforbinding havde en gennemsnitlig sårstørrelse på 3,1 mm2, hvilket ikke er ægte. nåede statistisk signifikans (figur 3M). p = 0,423). Sår behandlet med Ag1+ eller Ag1++ EDTA/BC viste ingen reduktion i sårområdet (henholdsvis 3,1 mm2 og 3,6 mm2). Behandling med iltet AG-saltdressing Fremmet genepitelisering i større grad end den ikke-antimikrobielle kontroldressing (henholdsvis 34% og 15%; Figur 3n). . henholdsvis).
Lignende tendenser i sårområdet og epitel -regenerering blev observeret i sår inficeret med S. aureus -biofilmer (figur 3O). Omklædninger indeholdende iltede sølvsalte reducerede sårområdet (2,0 mm2) med 23% sammenlignet med kontrol-ikke-antimikrobiel dressing (2,6 mm2), skønt denne reduktion ikke var signifikant (p = 0,304) (fig. 3O). Derudover blev sårområdet i AG1+ -behandlingsgruppen lidt reduceret (2,4 mm2), mens såret behandlet med AG1++ EDTA/BC -dressing ikke reducerede sårområdet (2,9 mm2). Oxygen-salte af Ag fremmede også re-epitelisering af sår inficeret med S. aureus-biofilm (31%) i større grad end dem, der blev behandlet med ikke-antimikrobielle kontroldressinger (12%, P = 0,003) (figur 3P). AG1+ dressing (16%, P = 0,903) og Ag+ 1+ EDTA/BC -forbinding (14%, P = 0,965) viste niveauer af epitelial regenerering svarende til kontrol.
For at visualisere effekten af sølvdressinger på biofilmmatrixen blev Toto 1 og Syto 60 iodidfarvning udført (fig. 4). Toto 1 iodid er et celleimpermeabelt farvestof, der kan bruges til nøjagtigt at visualisere ekstracellulære nukleinsyrer, som er rigelige i EPS for biofilmer. SYTO 60 er en celle permeabelt farvestof, der bruges som et forsænkt16. Observationer af TOTO 1 og SYTO 60 iodid i sår inokuleret med biofilmer af Pseudomonas aeruginosa (figur 4A-D) og Staphylococcus aureus (figur 4i-L) viste, at EPS efter 3 dages klædningsbehandling i biofilmen blev reduceret. Indeholder iltede salte AG og AG1 + + EDTA/BC. AG1+ -klædninger uden yderligere antibiofilmkomponenter reducerede signifikant cellefrit DNA i sår inokuleret med Pseudomonas aeruginosa, men var mindre effektive i sår inokuleret med Staphylococcus aureus.
In vivo -billeddannelse af sårbiofilm efter 3 dages behandling med kontrol eller sølvdressinger. Konfokale billeder af Pseudomonas aeruginosa (A - D) og Staphylococcus aureus (I - L) farvet med TOTO 1 (grøn) for at visualisere ekstracellulære nukleinsyrer, en komponent af ekstracellulære biofilmpolymerer. For at plette intracellulære nukleinsyrer skal du bruge SYTO 60 (rød). syrer. P. Scanningselektronmikroskopi af sår inficeret med Pseudomonas aeruginosa (E - H) og Staphylococcus aureus (M - P) biofilmer efter 3 dages behandling med kontrol og sølvforbindinger. SEM Scale Bar = 5 um. Konfokal billeddannelsesskala bar = 50 um.
Scanning af elektronmikroskopi viste, at mus inokuleret med biofilmkolonier af Pseudomonas aeruginosa (figur 4E-H) og Staphylococcus aureus (figur 4M-P) havde signifikant færre bakterier i deres sår efter 3 dages behandling med alle sølvbøringer.
For at evaluere effekten af sølvdressinger på sårinflammation i biofilm-inficerede mus, var sektioner af biofilm-inficerede sår behandlet med kontrol eller sølvdressinger i 3 dage immunohistokemisk farvet ved anvendelse af antistoffer, der var specifikke for neutrofiler og makrofager. Kvantitativ bestemmelse af neutrofiler og makrofager internt. Granuleringsvæv. Figur 5). Alle sølvdressinger reducerede antallet af neutrofiler og makrofager i sår inficeret med Pseudomonas aeruginosa sammenlignet med ikke-antimikrobielle kontrolforbindinger efter tre dages behandling. Imidlertid resulterede behandling med den oxygenerede sølvsaltdressing i en større reduktion i neutrofiler (p = <0,0001) og makrofager (p = <0,0001) sammenlignet med andre testede sølvdressinger (figur 5i, j). Selvom AG1++ EDTA/BC havde en større effekt på sårbiofilm, reducerede det neutrofile og makrofagniveauer i mindre grad end AG1+ -klædningen. Moderat sår inficeret med S. aureus -biofilm blev også observeret efter påklædning med Ag (p = <0,0001), Ag1+ (p = 0,0008) og Ag1 ++ EDTA/BC (p = 0,0043) oxisoler sammenlignet med kontrol. Lignende tendenser observeres for neutropeni. Bandage (fig. 5K). Imidlertid viste kun den iltede Ag -saltdressing en signifikant reduktion i antallet af makrofager i granuleringsvæv sammenlignet med kontrol i sår inficeret med S. aureus -biofilmer (P = 0,0339) (figur 5L).
Neutrofiler og makrofager blev kvantificeret i sår inficeret med Pseudomonas aeruginosa og Staphylococcus aureus Biofilms efter 3 dages behandling med ikke-antimikrobiel kontrol eller sølvforbindinger. Neutrofiler (AD) og makrofager (EH) blev kvantificeret i vævsektioner farvet med antistoffer, der er specifikke for neutrofiler eller makrofager. Kvantificering af neutrofiler (I og K) og makrofager (J og L) i sår inficeret med Pseudomonas aeruginosa (I og J) og Staphylococcus aureus (K&L) biofilmer. N = 12 pr. Gruppe. Grafer viser gennemsnit +/- standardfejl, signifikansværdier sammenlignet med ikke-antibakteriel kontroldressing, * betyder p = <0,05, ** betyder p = <0,01; *** betyder p = <0,001; angiver p = <0,0001).
Vi vurderede derefter effekten af sølvdressinger på infektionsuafhængig helbredelse. Ikke-inficerede excisionsår blev behandlet med en ikke-antimikrobiel kontroldressing eller en sølvdressing i 3 dage (figur 6). Blandt de testede sølvdressinger syntes kun sår behandlet med den iltede saltdressing mindre på makroskopiske billeder end sår behandlet med kontrollen (figur 6A-D). Kvantificering af sårområdet ved anvendelse af histologisk analyse viste, at det gennemsnitlige sårområde efter behandling med Ag Oxysols -klædningen var 2,35 mm2 sammenlignet med 2,96 mm2 for sår behandlet med kontrolgruppen, men denne forskel nåede ikke statistisk betydning (p = 0,488) (fig . I modsætning hertil blev der ikke observeret nogen reduktion i sårområdet efter behandling med Ag1+ (3,38 mm2, p = 0,757) eller AG1++ EDTA/BC (4,18 mm2, p = 0,054) forbindinger sammenlignet med kontrolgruppen. Forøget epitel -regenerering blev observeret med Ag Oxysol -forbinding sammenlignet med kontrolgruppen (henholdsvis 30% mod 22%), skønt dette ikke nåede betydning (p = 0,067), dette er ganske betydningsfuldt og bekræfter tidligere resultater. En dressing med Oxysols fremmer genepitelisering. -Pithelisering af uinficerede sår17. I modsætning hertil havde behandling med AG1+ eller AG1++ EDTA/BC-forbindinger ingen virkning eller viste nedsat re-epitelisering sammenlignet med kontrol.
Effekt af sølv sårklædning på sårheling hos uinficerede mus med komplet resektion. (AD) Repræsentative makroskopiske billeder af sår efter tre dages behandling med en ikke-antimikrobiel kontroldressing og en sølvdressing. (Eh) Repræsentative sårsektioner farvet med hæmatoxylin og eosin. Kvantificering af sårområdet (I) og procentdel af reepitelialisering (J) blev beregnet ud fra histologiske sektioner i midtpunktet af såret ved anvendelse af billedanalyse -software (n = 11–12 pr. Behandlingsgruppe). Grafer viser gennemsnit +/- standardfejl. * betyder p = <0,05.
Sølv har en lang historie med brug som en antimikrobiel terapi i sårheling, men de mange forskellige formuleringer og leveringsmetoder kan resultere i forskelle i antimikrobiel effektivitet 18. Desuden forstås antibiofilmegenskaberne ved specifikke sølvleveringssystemer ikke fuldt ud. Selvom værtsimmunresponsen er relativt effektiv mod planktoniske bakterier, er den generelt mindre effektiv mod biofilm19. Planktoniske bakterier er let fagocytoseret af makrofager, men inden for biofilm udgør aggregerede celler yderligere problemer ved at begrænse værtsresponsen i det omfang, at immunceller kan gennemgå apoptose og frigive proinflammatoriske faktorer for at forbedre immunresponsen20. Det er blevet observeret, at nogle leukocytter kan trænge ind i Biofilms21, men ikke er i stand til at fagocytose bakterier, når dette forsvar er kompromitteret22. En holistisk tilgang skal bruges til at understøtte værtsimmunresponsen mod sårbiofilminfektion. Sårdebridement kan fysisk forstyrre biofilmen og fjerne det meste af Bioburden, men værtsimmunresponsen kan være ineffektiv mod resterende biofilm, især hvis værtsimmunresponsen kompromitteres. Således kan antimikrobielle terapier, såsom sølvdressinger, understøtte værtsimmunresponsen og eliminere biofilminfektioner. Sammensætning, koncentration, opløselighed og leveringssubstrat kan påvirke den antimikrobielle effektivitet af sølv. I de senere år har fremskridt inden for sølvforarbejdningsteknologi gjort disse forbindinger mere effektive9,23. Efterhånden som sølvdressingsteknologien skrider frem, er det vigtigt at forstå effektiviteten af disse forbindinger til at kontrollere sårinfektion og, endnu vigtigere, virkningen af disse potente former for sølv på sårmiljøet og helingen.
I denne undersøgelse sammenlignede vi effektiviteten af to avancerede sølvdressinger med konventionelle sølvdressinger, der producerer AG1+ -ioner mod biofilmer ved hjælp af forskellige in vitro- og in vivo -modeller. Vi vurderede også effekten af disse forbindinger på sårmiljøet og infektionsuafhængig helbredelse. For at minimere påvirkningen af leveringsmatrixen var alle testede sølvdressinger sammensat af carboxymethylcellulose.
Vores foreløbige evaluering af disse sølvdressinger mod koloniale biofilmer af Pseudomonas aeruginosa og Staphylococcus aureus viser, at i modsætning til traditionelle AG1+ -klædninger, to avancerede sølvdressinger, AG1++ EDTA/BC og oxygeneret AG -salte, er effektive til 5. Effektivt dræbende biofilm bakterier inden for inden for inden for et par dage. Derudover forhindrer disse forbindinger omdannelse af biofilm ved gentagen eksponering for planktoniske bakterier. AG1+ -klædningen indeholdt sølvchlorid, den samme sølvforbindelse og basismatrix som AG1++ EDTA/BC, og havde en begrænset effekt på bakteriel levedygtighed inden for biofilmen i samme periode. Observationen om, at en AG1++ EDTA/BC -dressing var mere effektiv mod biofilm end en AG1+ -klædning bestående af den samme matrix og en sølvforbindelse understøtter forestillingen om, at der kræves yderligere ingredienser for at øge effektiviteten af sølvchlorid mod biofilm, som rapporteret andre steder15. Disse resultater understøtter ideen om, at BC og EDTA spiller en yderligere rolle, der bidrager til den samlede påklædningseffektivitet, og at fraværet af denne komponent i AG1+ -klædninger kan have bidraget til manglen på at demonstrere in vitro -effektivitet. Vi fandt, at iltede Ag -saltdressinger, der producerede AG2+ og Ag3+ -ioner, udviste stærkere antibakteriel effektivitet end AG1+ og på niveauer svarende til AG1++ EDTA/BC. På grund af det høje redoxpotentiale er det imidlertid uklart, hvor længe AG3+ -ioner forbliver aktive og effektive mod sårbiofilmer og derfor fortjener yderligere undersøgelse. Derudover er der mange forskellige forbindinger, der genererer AG1+ -ioner, der ikke blev testet i denne undersøgelse. Disse forbindinger er sammensat af forskellige sølvforbindelser, koncentrationer og basismatrixer, hvilket kan have indflydelse på levering af Ag1+ -ioner og deres effektivitet mod biofilmer. Det er også værd at bemærke, at der er mange forskellige in vitro- og in vivo -modeller, der bruges til at evaluere effektiviteten af sårforbindelser mod biofilmer. Den anvendte type model såvel som salt- og proteinindholdet i de medier, der er anvendt i disse modeller, vil påvirke omklædningens effektivitet. I vores in vivo -model lod vi biofilmen modnes in vitro og overførte den derefter til sårets dermale overflade. Værtsmusimmunresponsen er relativt effektiv mod planktoniske bakterier påført såret og danner derved en biofilm, når såret heles. Tilsætningen af moden biofilm til en sår begrænser effektiviteten af værtsimmunresponsen på dannelse af biofilm ved at lade den modne biofilm etablere sig inden for såret, før heling kan begynde. Således giver vores model os mulighed for at evaluere effektiviteten af antimikrobielle forbindinger på modne biofilmer, før sår begynder at heles.
Vi fandt også, at dressing fit påvirkede effektiviteten af sølvdressinger på in vitro-dyrkede biofilmer og porcine hud. Luk kontakt med såret betragtes som kritisk for den antimikrobielle effektivitet af dressing24,25. Omklædninger indeholdende oxygenerede Ag -salte var i tæt kontakt med modne biofilmer, hvilket resulterede i en signifikant reduktion i antallet af levedygtige bakterier i biofilmen efter 24 timer. I modsætning hertil, når de blev behandlet med AG1+ og AG1++ EDTA/BC -forbindinger, var det betydelige antal levedygtige bakterier tilbage. Disse forbindinger indeholder suturer langs hele forbindingens længde, hvilket skaber døde rum, der forhindrer tæt kontakt med biofilmen. I vores in vitro-studier forhindrede disse ikke-kontaktområder drab af levedygtige bakterier inden for biofilmen. Vi vurderede bakteriel levedygtighed først efter 24 timers behandling; Efterhånden som forbindingen bliver mere mættet, kan der være mindre død rum, hvilket reducerer området for disse levedygtige bakterier. Dette fremhæver dog vigtigheden af sammensætningen af bandagen, ikke kun den type sølv i bandagen.
Mens in vitro -undersøgelser er nyttige til at sammenligne effektiviteten af forskellige sølvteknologier, er det også vigtigt at forstå virkningerne af disse forbindinger på biofilmer in vivo, hvor værtsvæv og immunrespons bidrager til effektiviteten af forbindingerne mod biofilmer. Effekten af disse forbindinger på sårbiofilmer blev observeret under anvendelse af scanningselektronmikroskopi og EPS -farvning af biofilmen under anvendelse af intracellulære og ekstracellulære DNA -farvestoffer. Vi fandt, at efter 3 dages behandling var alle forbindinger effektive til at reducere cellefrit DNA i biofilm-inficerede sår, men AG1+ -klædningen var mindre effektiv i Staphylococcus aureus-inficerede sår. Scanning af elektronmikroskopi viste også, at der var signifikant mindre bakterier til stede i sår behandlet med sølvdressingerne, skønt dette var mere udtalt med den iltede Ag -saltdressing og AG1++ EDTA/BC -forbinding sammenlignet med AG1+ -klædningen. Disse data viser, at de testede sølvdressinger havde forskellige grader af påvirkning af biofilmstrukturen, men ingen af sølvdressingerne var i stand til at udrydde biofilmen, hvilket understøtter behovet for en holistisk tilgang til behandling af sårbiofilminfektioner; Brug af sølvarmbånd. Behandlingen forud for fysisk debridement for at fjerne det meste af biofilmen.
Kroniske sår er ofte i en tilstand af svær betændelse, med overskydende inflammatoriske celler tilbage i sårvævet i en længere periode, hvilket forårsager vævsskade og udtømmede det ilt, der er nødvendigt for effektiv cellulær metabolisme og funktion i såret26. Biofilmer forværrer dette fjendtlige sårmiljø ved negativt at påvirke heling på forskellige måder, herunder inhibering af celleproliferation og migration og aktivering af proinflammatoriske cytokines27. Efterhånden som sølvforbindinger bliver mere effektive, er det vigtigt at forstå den indflydelse, de har på sårmiljøet og helbredelse.
Interessant nok, selvom alle sølvdressinger påvirkede biofilmsammensætningen, øgede kun oxygeneret sølvsaltdressinger genpitelisering af disse inficerede sår. Disse data understøtter vores tidligere fund17 og dem fra Kalan et al. (2017) 28, der demonstrerede god sikkerhed og toksicitetsprofiler af iltede sølvsalte, da lavere koncentrationer af sølv var effektive mod biofilmer.
Vores nuværende undersøgelse fremhæver forskellene i sølvteknologi mellem antimikrobielle sølvdressinger og virkningen af denne teknologi på sårmiljøet og infektionsuafhængig helbredelse. Imidlertid adskiller disse resultater sig fra tidligere undersøgelser, der viser, at AG1 + + EDTA/BC -dressing forbedrede helingsparametre for sårede kaninører in vivo. Dette kan dog skyldes forskelle i dyremodeller, målingstider og bakterielle anvendelsesmetoder29. I dette tilfælde blev der taget sårmålinger 12 dage efter skade for at tillade, at de aktive ingredienser i forbindingen kan handle på biofilmen over en længere periode. Dette understøttes af en undersøgelse, der viste, at klinisk inficerede bensår behandlet med AG1 + + EDTA/BC oprindeligt steg i størrelse efter en uges behandling og derefter i løbet af de næste 3 ugers behandling med AG1 + + EDTA/BC og inden for 4 uger efter Brug af ikke-antimikrobielle stoffer. medicin. CMC -forbindinger for at reducere størrelsen på mavesår30.
Visse former og koncentrationer af sølv har tidligere vist sig at være cytotoksisk in vitro 11, men disse in vitro -resultater oversættes ikke altid til bivirkninger in vivo. Derudover har fremskridt inden for sølvteknologi og en bedre forståelse af sølvforbindelser og koncentrationer i forbindinger ført til udviklingen af mange sikre og effektive sølvdressinger. Efterhånden som sølvdressingsteknologien skrider frem, er det vigtigt at forstå virkningen af disse forbindinger på sårmiljøet31,32,33. Det blev tidligere rapporteret, at den øgede hastighed for re-epitelisering svarer til en øget andel af antiinflammatoriske M2-makrofager sammenlignet med den pro-inflammatoriske M1-fænotype. Dette blev bemærket i en tidligere musemodel, hvor sølvhydrogel sårforbindinger blev sammenlignet med sølvsulfadiazin og ikke-antimikrobielle hydrogeler34.
Kroniske sår kan udvise overdreven betændelse, og det er blevet observeret, at tilstedeværelsen af overskydende neutrofiler kan være skadelig for sårheling35. I en undersøgelse i neutrofil-udtømmede mus forsinkede tilstedeværelsen af neutrofiler reepithelialisering. Tilstedeværelsen af overskydende neutrofiler fører til høje niveauer af proteaser og reaktive iltarter, såsom superoxid og hydrogenperoxid, som er forbundet med kroniske og langsomt helende sår37,38. Ligeledes kan en stigning i makrofagnumre, hvis ukontrolleret, føre til forsinket sårheling39. Denne stigning er især vigtig, hvis makrofager ikke er i stand til at skifte fra en pro-inflammatorisk fænotype til en pro-helende fænotype, hvilket resulterer i, at sår ikke afslutter den inflammatoriske fase af Healing40. Vi observerede et fald i neutrofiler og makrofager i biofilm-inficerede sår efter 3 dages behandling med alle sølvdressinger, men faldet var mere udtalt med iltede saltdressinger. Dette fald kan være et direkte resultat af immunresponsen på sølv, et svar på nedsat bioburden, eller såret er i et senere stadium af heling og derfor immunceller i såret reduceres. At reducere antallet af inflammatoriske celler i såret kan opretholde et miljø, der er befordrende for sårheling. Mekanismen for virkning af, hvordan Ag Oxysalts fremmer infektionsuafhængig heling er uklar, men evnen hos Ag Oxysalts til at producere ilt og ødelægge skadelige niveauer af brintperoxid, en mægler af betændelse, kan muligvis forklare dette og kræver yderligere undersøgelse17.
Kroniske ikke-helende inficerede sår udgør et problem for både læger og patienter. Selvom mange forbindinger hævder antimikrobiel effektivitet, fokuserer forskning sjældent på andre nøglefaktorer, der påvirker sårmikromiljøet. Denne undersøgelse viser, at forskellige sølvteknologier har forskellige antimikrobielle effektivitet og vigtigst af alt forskellige effekter på sårmiljøet og helbredelse, uafhængigt af infektion. Selvom disse in vitro- og in vivo -undersøgelser viser effektiviteten af disse forbindinger til behandling af sårinfektioner og fremme af heling, er randomiserede kontrollerede forsøg nødvendige for at evaluere effektiviteten af disse forbindinger i klinikken.
De anvendte datasæt og/eller analyseret under den aktuelle undersøgelse er tilgængelige fra den tilsvarende forfatter på rimelig anmodning.
Posttid: Jul-15-2024