Tak for dit besøg på Nature.com. Den browserversion, du bruger, har begrænset CSS-understøttelse. For at opnå de bedste resultater anbefaler vi, at du bruger en nyere version af din browser (eller deaktiverer kompatibilitetstilstand i Internet Explorer). I mellemtiden viser vi webstedet uden styling eller JavaScript for at sikre løbende support.
Mikrobiel vækst i sår manifesterer sig ofte som biofilm, som forstyrrer heling og er vanskelige at udrydde. Nye sølvforbindinger hævder at bekæmpe sårinfektioner, men deres antibiofilm-effektivitet og infektionsuafhængige helingseffekter er generelt ukendte. Ved hjælp af in vitro- og in vivo-biofilmmodeller af Staphylococcus aureus og Pseudomonas aeruginosa rapporterer vi effektiviteten af Ag1+-iongenererende forbindinger; Ag1+-forbindinger indeholdende ethylendiamintetraeddikesyre og benzethoniumchlorid (Ag1+/EDTA/BC), og forbindinger indeholdende sølvnitrat (Ag-oxysalte), som producerer Ag1+-, Ag2+- og Ag3+-ioner for at bekæmpe sårbiofilm og dens effekt på heling. Ag1+-forbindinger havde minimal effekt på sårbiofilm in vitro og hos mus (C57BL/6j). I modsætning hertil reducerede iltede Ag-salte og Ag1+/EDTA/BC-forbindinger signifikant antallet af levedygtige bakterier i biofilm in vitro og udviste en signifikant reduktion af bakterielle og EPS-komponenter i musesårsbiofilm. Disse forbindinger havde forskellige effekter på helingen af biofilm-inficerede og ikke-biofilm-inficerede sår, hvor iltede saltforbindinger havde mere gavnlige effekter på reepitelisering, sårstørrelse og inflammation sammenlignet med kontrolbehandlinger og andre sølvforbindinger. De forskellige fysisk-kemiske egenskaber ved sølvforbindinger kan have forskellige effekter på sårbiofilm og heling, og dette bør tages i betragtning ved valg af en forbinding til behandling af biofilm-inficerede sår.
Kroniske sår defineres som "sår, der ikke gennemgår de normale helingsstadier på en ordnet og rettidig måde"1. Kroniske sår skaber en psykologisk, social og økonomisk byrde for patienter og sundhedssystemet. De årlige NHS-udgifter til behandling af sår og tilhørende komorbiditeter anslås til 8,3 milliarder pund i 2017-182. Kroniske sår er også i øjeblikket et presserende problem i USA, hvor Medicare anslår de årlige omkostninger ved behandling af patienter med sår til 28,1-96,8 milliarder dollars3.
Infektion er en væsentlig faktor, der forhindrer sårheling. Infektioner manifesterer sig ofte som biofilm, som er til stede i 78 % af ikke-helende kroniske sår. Biofilm dannes, når mikroorganismer bliver irreversibelt bundet til overflader, såsom såroverflader, og kan aggregere og danne ekstracellulære polymer (EPS)-producerende samfund. Sårbiofilm er forbundet med en øget inflammatorisk reaktion, der fører til vævsskade, som kan forsinke eller forhindre heling4. Stigningen i vævsskade kan delvist skyldes øget aktivitet af matrixmetalloproteinaser, kollagenase, elastase og reaktive iltarter5. Desuden er inflammatoriske celler og biofilm selv store forbrugere af ilt og kan derfor forårsage lokal vævshypoksi, hvilket udtømmer celler for den vitale ilt, der er nødvendig for effektiv vævsreparation6.
Modne biofilm er meget resistente over for antimikrobielle stoffer, hvilket kræver aggressive strategier til at kontrollere biofilminfektioner, såsom mekanisk behandling efterfulgt af effektiv antimikrobiel behandling. Fordi biofilm hurtigt kan regenerere, kan effektive antimikrobielle stoffer reducere risikoen for redannelse efter kirurgisk debridement7.
Sølv anvendes i stigende grad i antimikrobielle forbindinger og bruges ofte som førstelinjebehandling af kronisk inficerede sår. Der findes mange kommercielt tilgængelige sølvforbindinger, der hver indeholder en forskellig sølvsammensætning, koncentration og basematrix. Fremskridt inden for sølvarmbånd har ført til udviklingen af nye sølvarmbånd. Den metalliske form af sølv (Ag0) er inert; for at opnå antimikrobiel effektivitet skal den miste en elektron for at danne ionisk sølv (Ag1+). Traditionelle sølvforbindinger indeholder sølvforbindelser eller metallisk sølv, som, når de udsættes for væske, nedbrydes til dannelse af Ag1+-ioner. Disse Ag1+-ioner reagerer med bakteriecellen og fjerner elektroner fra strukturelle komponenter eller kritiske processer, der er nødvendige for overlevelse. Patenteret teknologi har ført til udviklingen af en ny sølvforbindelse, Ag-oxysalte (sølvnitrat, Ag7NO11), som er inkluderet i sårforbindinger. I modsætning til traditionelt sølv producerer nedbrydningen af iltholdige salte sølvtilstande med højere valens (Ag1+, Ag2+ og Ag3+). In vitro-studier har vist, at lave koncentrationer af iltede sølvsalte er mere effektive end enkeltionsølv (Ag1+) mod patogene bakterier såsom Pseudomonas aeruginosa, Staphylococcus aureus og Escherichia coli8,9. En anden ny type sølvforbinding indeholder yderligere ingredienser, nemlig ethylendiamintetraeddikesyre (EDTA) og benzethoniumchlorid (BC), som angiveligt er målrettet mod biofilm-EPS og derved øger sølvets penetration i biofilmen. Disse nye sølvteknologier tilbyder nye måder at målrette sårbiofilm på. Imidlertid er virkningen af disse antimikrobielle stoffer på sårmiljøet og infektionsuafhængig heling vigtig for at sikre, at de ikke skaber et ugunstigt sårmiljø eller forsinker heling. Bekymringer om in vitro-sølvcytotoksicitet er blevet rapporteret med flere sølvforbindinger10,11. In vitro-cytotoksicitet har dog endnu ikke oversat sig til in vivo-toksicitet, og flere Ag1+-forbindinger har vist en god sikkerhedsprofil12.
Her undersøgte vi effektiviteten af carboxymethylcelluloseforbindinger indeholdende nye sølvformuleringer mod sårbiofilm in vitro og in vivo. Derudover blev virkningerne af disse forbindinger på immunresponser og heling uafhængigt af infektion vurderet.
Alle anvendte forbindinger var kommercielt tilgængelige. 3M Kerracel Gel Fiber Dressing (3M, Knutsford, Storbritannien) er en ikke-antimikrobiel 100% carboxymethylcellulose (CMC) gelfiberforbinding, der blev brugt som kontrolforbinding i dette studie. Tre antimikrobielle CMC sølvforbindinger blev evalueret, nemlig 3M Kerracel Ag-forbinding (3M, Knutsford, Storbritannien), som indeholder 1,7 vægt% oxygeneret sølvsalt (Ag7NO11) i sølvioner med højere valens (Ag1+, Ag2+ og Ag3+). Under nedbrydningen af Ag7NO11 dannes Ag1+, Ag2+ og Ag3+ ioner i et forhold på 1:2:4. Aquacel Ag Extra forbinding indeholdende 1,2% sølvklorid (Ag1+) (ConvaTec, Deeside, Storbritannien) 13 og Aquacel Ag + Extra forbinding indeholdende 1,2% sølvklorid (Ag1+), EDTA og benzethoniumklorid (ConvaTec, Deeside, Storbritannien) 14.
De stammer, der blev anvendt i dette studie, var Pseudomonas aeruginosa NCTC 10781 (Public Health England, Salisbury) og Staphylococcus aureus NCTC 6571 (Public Health England, Salisbury).
Bakterier blev dyrket natten over i Muller-Hinton-bouillon (Oxoid, Altrincham, Storbritannien). Kulturen natten over blev derefter fortyndet 1:100 i Mueller-Hinton-bouillon og 200 µl udpladet på sterile 0,2 µm Whatman cyclopore-membraner (Whatman plc, Maidstone, Storbritannien) på Mueller-Hinton-agarplader (Sigma-Aldrich Company Ltd, Kent, Storbritannien). Dannelse af kolonial biofilm ved 37°C i 24 timer. Disse koloniale biofilm blev testet for logaritmisk krympning.
Skær forbindingen i 3 cm2 store stykker, og fugt dem forinden med sterilt, deioniseret vand. Placer forbindingen over koloniens biofilm på agarpladen. For hver 24 ha biofilm blev fjernet, og levedygtige bakterier i biofilmen (CFU/ml) blev kvantificeret ved seriefortynding (10⁻⁹ til 10⁻⁹) i Day-Angle neutraliseringsbouillon (Merck-Millipore). Efter 24 timers inkubation ved 37°C blev der udført standardpladetællinger på Mueller-Hinton agarplader. Hver behandling og tidspunkt blev udført i triplikat, og pladetællinger blev gentaget for hver fortynding.
Svinebryst udtages fra hungrise af typen Large White inden for 15 minutter efter slagtning i overensstemmelse med EU's eksportstandarder. Huden blev barberet og rengjort med alkoholservietter og derefter frosset ved -80 °C i 24 timer for at devitalisere huden. Efter optøning blev 1 cm2 hudstykker vasket tre gange med PBS, 0,6 % natriumhypochlorit og 70 % ethanol i 20 minutter hver gang. Før epidermis fjernes, fjernes eventuel resterende ethanol ved at vaske 3 gange i sterilt PBS. Huden blev dyrket i en 6-brønds plade med en 0,45 μm tyk nylonmembran (Merck-Millipore) ovenpå og 3 absorberende puder (Merck-Millipore) indeholdende 3 ml føtalt bovint serum (Sigma) suppleret med 10 % Dulbecco's modificerede Eagle Medium (Dulbecco's Modified Eagle Medium – Aldrich Ltd.).
Koloniale biofilm blev dyrket som beskrevet for biofilmeksponeringsstudier. Efter dyrkning af biofilmen på membranen i 72 timer blev biofilmen påført hudoverfladen ved hjælp af en steril inokuleringsløkke, og membranen blev fjernet. Biofilmen blev derefter inkuberet på grisens dermis i yderligere 24 timer ved 37°C for at lade biofilmen modnes og hæfte til grisens hud. Efter at biofilmen var modnet og fæstnet, blev en 1,5 cm2 forbinding, forfugtet med sterilt destilleret vand, påført direkte på hudoverfladen og inkuberet ved 37°C i 24 timer. Levedygtige bakterier blev visualiseret ved farvning ved ensartet påføring af PrestoBlue-cellelevedygtighedsreagens (Invitrogen, Life Technologies, Paisley, UK) på den apikale overflade af hvert eksplantat og inkubering i 5 minutter. Brug Leica DFC425 digitalkameraet til øjeblikkeligt at optage billeder på Leica MZ8-mikroskopet. Områder farvet lyserøde blev kvantificeret ved hjælp af Image Pro software version 10 (Media Cybernetics Inc, Rockville, MD Image-Pro (mediacy.com)). Scanningselektronmikroskopi blev udført som beskrevet nedenfor.
Bakterier dyrket natten over blev fortyndet 1:100 i Mueller-Hinton-bouillon. 200 μl kultur blev tilsat til en steril 0,2 μm Whatman cyclopore-membran (Whatman, Maidstone, Storbritannien) og udpladet på Mueller-Hinton-agar. Biofilmplader blev inkuberet ved 37 °C i 72 timer for at muliggøre dannelse af moden biofilm.
Efter 3 dages biofilmmodning blev en 3 cm2 firkantet bandage placeret direkte på biofilmen og inkuberet ved 37 °C i 24 timer. Efter at bandagen var fjernet fra biofilmoverfladen, blev 1 ml PrestoBlue Cell Viability Reagent (Invitrogen, Waltham, MA) tilsat overfladen af hver biofilm i 20 sekunder. Overfladerne blev tørret, før farveændringerne blev registreret med et Nikon D2300 digitalkamera (Nikon UK Ltd., Kingston, Storbritannien).
Forbered natten over-kulturer på Mueller-Hinton agar, overfør individuelle kolonier til 10 ml Mueller-Hinton bouillon og inkuber på en rystemaskine ved 37°C (100 rpm). Efter natten over-inkubation blev kulturen fortyndet 1:100 i Mueller-Hinton bouillon, og 300 µl blev dryppet på en 0,2 µm cirkulær Whatman cyclopore-membran (Whatman International, Maidstone, UK) på Mueller-Hinton agar og inkuberet ved 37°C inden for 72 timer. Den modne biofilm blev påført såret som beskrevet nedenfor.
Alt arbejde med dyr blev udført på University of Manchester under en projektlicens godkendt af Office of Animal Welfare and Ethical Review (P8721BD27) og i overensstemmelse med retningslinjer offentliggjort af Home Office under den reviderede ASPA fra 2012. Alle forfattere overholdt ankomstretningslinjerne. Otte uger gamle C57BL/6j-mus (Envigo, Oxon, Storbritannien) blev anvendt til alle in vivo-studier. Mus blev bedøvet med isofluran (Piramal Critical Care Ltd, West Drayton, Storbritannien), og deres dorsale overflader blev barberet og rengjort. Hver mus fik derefter et 2 × 6 mm excisionssår ved hjælp af en Stiefel biopsipunch (Schuco International, Hertfordshire, Storbritannien). For biofilminficerede sår påføres 72-timers kolonial biofilm dyrket på membranen som beskrevet ovenfor på sårets dermale lag ved hjælp af en steril inokuleringsløkke umiddelbart efter skaden, og membranen kasseres. En kvadratcentimeter forbinding forfugtes med sterilt vand for at opretholde et fugtigt sårmiljø. Forbindinger blev påført direkte på hvert sår og dækket med 3M Tegaderm-film (3M, Bracknell, Storbritannien) og Mastisol flydende klæbemiddel (Eloquest Healthcare, Ferndale, MI) påført rundt om kanterne for at give yderligere vedhæftning. Buprenorphin (Animalcare, York, Storbritannien) blev administreret i en koncentration på 0,1 mg/kg som smertestillende middel. Musene blev aflivet tre dage efter skaden ved hjælp af Schedule 1-metoden, og sårområdet blev fjernet, halveret og opbevaret efter behov.
Hæmatoxylin (ThermoFisher Scientific) og eosin (ThermoFisher Scientific) farvning blev udført i henhold til producentens protokol. Sårareal og reepitelisering blev kvantificeret ved hjælp af Image Pro software version 10 (Media Cybernetics Inc, Rockville, MD).
Vævssektioner blev afvokset i xylen (ThermoFisher Scientific, Loughborough, UK), rehydreret med 100-50% graderet ethanol og kortvarigt nedsænket i deioniseret vand (ThermoFisher Scientific). Immunhistokemi blev udført ved hjælp af VectaStain Elite ABC PK-6104-kittet (Vector Laboratories, Burlingame, CA) i henhold til producentens protokol. Primære antistoffer mod neutrofiler NIMP-R14 (Thermofisher Scientific) og makrofager Ms CD107b Pure M3/84 (BD Biosciences, Wokingham, UK) blev fortyndet 1:100 i blokeringsopløsning og tilsat snitfladen, efterfulgt af 2 antistoffer Anti-, VectaStain ABC og Vector Nova Red Peroxidase (HRP) substratkit (Vector Laboratories, Burlingame, CA) og modfarvet med hæmatoxylin. Billeder blev erhvervet ved hjælp af et Olympus BX43-mikroskop og et Olympus DP73 digitalkamera (Olympus, Southend-on-Sea, Storbritannien).
Hudprøver blev fikseret i 2,5% glutaraldehyd og 4% formaldehyd i 0,1 M HEPES (pH 7,4) i 24 timer ved 4°C. Prøverne blev dehydreret ved hjælp af graderet ethanol og tørret i CO2 ved hjælp af en Quorum K850 kritisk punkttørrer (Quorum Technologies Ltd, Loughton, Storbritannien) og sputterbelagt med en guld-palladium-legering ved hjælp af et Quorum SC7620 mini sputterer/glødudladningssystem. Prøverne blev afbildet ved hjælp af et FEI Quanta 250 scanningselektronmikroskop (ThermoFisher Scientific) for at visualisere sårets centrale punkt.
Toto-1-iodid (2 μM) blev påført den udskårne musesåroverflade og inkuberet i 5 minutter ved 37 °C (ThermoFisher Scientific) og behandlet med Syto-60 (10 μM) ved 37 °C (ThermoFisher Scientific). 15-minutters Z-stack-billeder blev oprettet ved hjælp af en Leica TCS SP8.
Biologiske og tekniske replikatdata blev opstillet og analyseret ved hjælp af Graphpad Prism V9-software (GraphPad Software, La Jolla, CA). Envejsvariansanalyse med multiple sammenligninger ved hjælp af Dunnetts post hoc-test blev brugt til at teste for forskelle mellem hver behandling og den ikke-antimikrobielle kontrolforbinding. En p-værdi <0,05 blev betragtet som signifikant.
Effektiviteten af sølvgel-fiberforbindinger blev først vurderet mod biofilmkolonier af Staphylococcus aureus og Pseudomonas aeruginosa in vitro. Sølvforbindinger indeholder forskellige formler af sølv: traditionelle sølvforbindinger producerer Ag1+-ioner; sølvforbindinger, som kan producere Ag1+-ioner efter tilsætning af EDTA/BC, kan ødelægge biofilmmatrixen og udsætte bakterier for sølv under den antibakterielle effekt af sølvioner15, og forbindinger, der indeholder iltede Ag-salte, som producerer Ag1+-, Ag2+- og Ag3+-ioner. Dens effektivitet blev sammenlignet med en ikke-antimikrobiel kontrolforbinding lavet af gelerede fibre. Resterende levedygtige bakterier i biofilmen blev vurderet hver 24. time i 8 dage (figur 1). På dag 5 blev biofilmen geninjuleret med 3,85 × 105S. Staphylococcus aureus eller 1,22×105P. aeruginosa for at vurdere biofilmgendannelse. Sammenlignet med ikke-antimikrobielle kontrolforbindinger havde Ag1+ forbindinger minimal effekt på bakteriel levedygtighed i Staphylococcus aureus og Pseudomonas aeruginosa biofilm over 5 dage. I modsætning hertil var forbindinger indeholdende iltet Ag og Ag1+ + EDTA/BC-salte effektive til at dræbe bakterier i biofilmen inden for 5 dage. Efter gentagen podning med planktoniske bakterier på dag 5 blev der ikke observeret nogen genoprettelse af biofilmen (fig. 1).
Kvantificering af levedygtige bakterier i Staphylococcus aureus og Pseudomonas aeruginosa biofilm efter behandling med sølvforbindinger. Biofilmkolonier af Staphylococcus aureus og Pseudomonas aeruginosa blev behandlet med sølvforbindinger eller ikke-antimikrobielle kontrolforbindinger, og antallet af tilbageværende levedygtige bakterier blev bestemt hver 24. time. Efter 5 dage blev biofilmen geninokuleret med 3,85×105S. Staphylococcus aureus eller 1,22×105P. Kolonier af bakterioplanktonet Pseudomonas aeruginosa blev dannet individuelt for at vurdere biofilmgendannelse. Grafer viser gennemsnitlig +/- standardfejl.
For at visualisere effekten af sølvforbindinger på biofilmens levedygtighed blev forbindinger påført modne biofilm dyrket på svinehud ex vivo. Efter 24 timer fjernes forbindingen, og biofilmen farves med et blåt reaktivt farvestof, som metaboliseres af levende bakterier til en lyserød farve. Biofilm behandlet med kontrolforbindinger var lyserøde, hvilket indikerer tilstedeværelsen af levedygtige bakterier i biofilmen (Figur 2A). I modsætning hertil var biofilmen behandlet med Ag-oxysolforbindingen primært blå, hvilket indikerer, at de resterende bakterier på overfladen af grisens hud var ikke-levedygtige bakterier (Figur 2B). Blandet blå og lyserød farvning blev observeret i biofilm behandlet med Ag1+-holdige forbindinger, hvilket indikerer tilstedeværelsen af levedygtige og ikke-levedygtige bakterier i biofilmen (Figur 2C), hvorimod EDTA/BC-forbindinger indeholdende Ag1+ overvejende var blå med nogle lyserøde pletter, hvilket indikerer områder, der ikke var påvirket af sølvforbindingen (Figur 2D). Kvantificering af aktive (lyserøde) og inaktive (blå) områder viste, at kontrolområdet var 75 % aktivt (Figur 2E). Ag1+ + EDTA/BC-forbindinger fungerede på samme måde som iltede Ag-saltforbindinger med overlevelsesrater på henholdsvis 13 % og 14 %. Ag1+-forbindingen reducerede også bakterielle levedygtigheder med 21 %. Disse biofilm blev derefter observeret ved hjælp af scanningselektronmikroskopi (SEM). Efter behandling med kontrolforbindingen og Ag1+-forbindingen blev der observeret et lag af Pseudomonas aeruginosa, der dækkede svinehuden (Figur 2F, H), hvorimod der efter behandling med Ag1+-forbindingen blev fundet få bakterieceller og få bakterieceller nedenunder. Kollagenfibre kan betragtes som vævsstrukturen i svinehud (Figur 2G). Efter behandling med Ag1+ + EDTA/BC-forbinding var bakterieplakker og underliggende kollagenfiberplakker synlige (Figur 2I).
Visualisering af Pseudomonas aeruginosa biofilm efter behandling med sølvforbinding. (A-D) Bakteriel levedygtighed i Pseudomonas aeruginosa biofilm dyrket på svinehud blev visualiseret ved hjælp af PrestoBlue levedygtighedsfarvestof 24 timer efter behandling med sølvforbindinger eller ikke-antimikrobielle kontrolforbindinger. Levende bakterier er lyserøde, ikke-levedygtige bakterier og svinehud er blå. (E) Kvantificering af Pseudomonas aeruginosa biofilm dyrket på svinehud (lyserød plet) ved hjælp af scanningselektronmikroskopi Image Pro version 10 (FI) og behandlet med en sølvforbinding eller en ikke-antimikrobiel kontrolforbinding i 24 timer. SEM-skalabar = 5 µm. (J-M) Koloniale biofilm voksede på filtre og blev farvet med PrestoBlue reaktivt farvestof efter 24 timers inkubation med sølvforbindinger.
For at afgøre, om tæt kontakt mellem forbindingerne og biofilmene påvirkede forbindingernes effektivitet, blev koloniale biofilm placeret på en plan overflade behandlet med forbindingerne i 24 timer og derefter farvet med reaktive farvestoffer. Den ubehandlede biofilm var mørkerosa i farven (Figur 2J). I modsætning til biofilm behandlet med forbindinger indeholdende iltede Ag-salte (Figur 2K) udviste biofilm behandlet med forbindinger indeholdende Ag1+ eller Ag1+ + EDTA/BC bånd af lyserød farvning (Figur 2L,M). Denne lyserøde farvning indikerer tilstedeværelsen af levedygtige bakterier og er forbundet med suturområdet i forbindingen. Disse indsyede områder skaber døde rum, der tillader bakterier i biofilmen at overleve.
For at evaluere effektiviteten af sølvforbindinger in vivo blev fuldtykkelsesudskårne sår fra mus inficeret med modne S. aureus- og P. aeruginosa-biofilm behandlet med ikke-antimikrobielle kontrolforbindinger eller sølvforbindinger. Efter 3 dages behandling viste makroskopisk billedanalyse mindre sårstørrelser ved behandling med iltede saltforbindinger sammenlignet med ikke-antimikrobielle kontrolforbindinger og andre sølvforbindinger (Figur 3A-H). For at bekræfte disse observationer blev sår indsamlet, og sårareal og reepitelisering blev kvantificeret på hæmatoxylin- og eosin-farvede vævssnit ved hjælp af Image Pro-software version 10 (Figur 3I-L).
Effekten af sølvforbindinger på såroverfladen og reepitelisering af sår inficeret med biofilm. (A-H) Små celler inficeret med biofilm af Pseudomonas aeruginosa (A-D) og Staphylococcus aureus (E-H) efter tre dages behandling med en ikke-antimikrobiel kontrolforbinding, en iltet Ag-saltforbinding, en Ag1+ forbinding og en Ag1+ forbinding. Repræsentative makroskopiske billeder. Sår fra mus med Ag1+ + EDTA/BC-forbinding. (IL) Repræsentativ Pseudomonas aeruginosa-infektion, histologiske snit farvet med hæmatoxylin og eosin, brugt til at kvantificere sårareal og epitelregenerering. Kvantificering af sårareal (M, O) og procentvis reepitelisering (N, P) af sår inficeret med Pseudomonas aeruginosa (M, N) og Staphylococcus aureus (O, P) biofilm (pr. behandlingsgruppe n = 12). Grafer viser gennemsnitlig +/- standardfejl. * betyder p = < 0,05 ** betyder p = < 0,01; Makroskopisk skala = 2,5 mm, histologisk skala = 500 µm.
Kvantificering af sårareal i sår inficeret med Pseudomonas aeruginosa biofilm (Figur 3M) viste, at sår behandlet med Ag-oxysalte havde en gennemsnitlig sårstørrelse på 2,5 mm2, mens den ikke-antimikrobielle kontrolforbinding havde en gennemsnitlig sårstørrelse på 3,1 mm2, hvilket ikke er sandt. nåede statistisk signifikans (Figur 3M). p = 0,423). Sår behandlet med Ag1+ eller Ag1+ + EDTA/BC viste ingen reduktion i sårareal (henholdsvis 3,1 mm2 og 3,6 mm2). Behandling med oxygeneret Ag-saltforbinding fremmede reepitelisering i større grad end den ikke-antimikrobielle kontrolforbinding (henholdsvis 34% og 15%; p = 0,029) og Ag1+ eller Ag1+ + EDTA/BC (henholdsvis 10% og 11%) (Figur 3N).
Lignende tendenser i sårareal og epitelregenerering blev observeret i sår inficeret med S. aureus biofilm (Figur 3O). Forbindinger indeholdende oxygenerede sølvsalte reducerede sårarealet (2,0 mm2) med 23% sammenlignet med den ikke-antimikrobielle kontrolforbinding (2,6 mm2), selvom denne reduktion ikke var signifikant (p = 0,304) (Fig. 3O). Derudover var sårarealet i Ag1+ behandlingsgruppen en smule reduceret (2,4 mm2), mens såret behandlet med Ag1+ + EDTA/BC-forbinding ikke reducerede sårarealet (2,9 mm2). Oxysalte af Ag fremmede også reepitelisering af sår inficeret med S. aureus biofilm (31%) i større grad end dem behandlet med ikke-antimikrobielle kontrolforbindinger (12%, p = 0,003) (Figur 3P). Ag1+ forbinding (16%, p = 0,903) og Ag+1 + EDTA/BC-forbinding (14%, p = 0,965) viste niveauer af epitelregenerering svarende til kontrolgruppen.
For at visualisere effekten af sølvforbindinger på biofilmmatrixen blev der udført Toto 1- og Syto 60-iodidfarvning (fig. 4). Toto 1-iodid er et celleimpermeabelt farvestof, der kan bruges til præcist at visualisere ekstracellulære nukleinsyrer, som er rigelige i EPS i biofilm. Syto 60 er et cellepermeabelt farvestof, der anvendes som kontrastfarve16. Observationer af Toto 1- og Syto 60-iodid i sår inokuleret med biofilm af Pseudomonas aeruginosa (figur 4A-D) og Staphylococcus aureus (figur 4I-L) viste, at efter 3 dages forbindingsbehandling var EPS i biofilmen signifikant reduceret. EPS indeholdende iltede salte Ag og Ag1+ + EDTA/BC. Ag1+-forbindinger uden yderligere antibiofilmkomponenter reducerede signifikant cellefrit DNA i sår inokuleret med Pseudomonas aeruginosa, men var mindre effektive i sår inokuleret med Staphylococcus aureus.
In vivo-billeddannelse af sårbiofilm efter 3 dages behandling med kontrol- eller sølvforbindinger. Konfokale billeder af Pseudomonas aeruginosa (A-D) og Staphylococcus aureus (I-L) farvet med Toto 1 (grøn) for at visualisere ekstracellulære nukleinsyrer, en komponent af ekstracellulære biofilmpolymerer. Brug Syto 60 (rød) til at farve intracellulære nukleinsyrer. P. Scanningselektronmikroskopi af sår inficeret med Pseudomonas aeruginosa (E-H) og Staphylococcus aureus (M-P) biofilm efter 3 dages behandling med kontrol- og sølvforbindinger. SEM-skalabar = 5 µm. Konfokal billeddannelsesskalabar = 50 µm.
Skanningselektronmikroskopi viste, at mus inokuleret med biofilmkolonier af Pseudomonas aeruginosa (Figur 4E-H) og Staphylococcus aureus (Figur 4M-P) havde signifikant færre bakterier i deres sår efter 3 dages behandling med udelukkende sølvforbindinger.
For at evaluere effekten af sølvforbindinger på sårinflammation hos biofilm-inficerede mus blev sektioner af biofilm-inficerede sår behandlet med kontrol- eller sølvforbindinger i 3 dage immunhistokemisk farvet ved hjælp af antistoffer specifikke for neutrofiler og makrofager. Kvantitativ bestemmelse af neutrofiler og makrofager internt. granulationsvæv. Figur 5). Alle sølvforbindinger reducerede antallet af neutrofiler og makrofager i sår inficeret med Pseudomonas aeruginosa sammenlignet med ikke-antimikrobielle kontrolforbindinger efter tre dages behandling. Behandling med den iltede sølvsaltforbinding resulterede dog i en større reduktion af neutrofiler (p = <0,0001) og makrofager (p = <0,0001) sammenlignet med andre testede sølvforbindinger (Figur 5I,J). Selvom Ag1+ + EDTA/BC havde en større effekt på sårbiofilm, reducerede det neutrofil- og makrofagniveauerne i mindre grad end Ag1+ forbindingen. Moderate sår inficeret med S. aureus biofilm blev også observeret efter forbinding med Ag (p = <0,0001), Ag1+ (p = 0,0008) og Ag1++ EDTA/BC (p = 0,0043) oxisoler sammenlignet med kontrolgruppen. Lignende tendenser observeres for neutropeni-bandagen (fig. 5K). Imidlertid viste kun den iltede Ag-saltforbinding en signifikant reduktion i antallet af makrofager i granulationsvæv sammenlignet med kontrolgruppen i sår inficeret med S. aureus biofilm (p = 0,0339) (figur 5L).
Neutrofiler og makrofager blev kvantificeret i sår inficeret med Pseudomonas aeruginosa og Staphylococcus aureus biofilm efter 3 dages behandling med ikke-antimikrobiel kontrol eller sølvforbindinger. Neutrofiler (AD) og makrofager (EH) blev kvantificeret i vævssnit farvet med antistoffer specifikke for neutrofiler eller makrofager. Kvantificering af neutrofiler (I og K) og makrofager (J og L) i sår inficeret med Pseudomonas aeruginosa (I og J) og Staphylococcus aureus (K & L) biofilm. N = 12 pr. gruppe. Grafer viser gennemsnit +/- standardfejl, signifikansværdier sammenlignet med ikke-antibakteriel kontrolforbinding, * betyder p = < 0,05, ** betyder p = < 0,01; *** betyder p = < 0,001; indikerer p = <0,0001).
Vi vurderede derefter effekten af sølvforbindinger på infektionsuafhængig heling. Ikke-inficerede excisionssår blev behandlet med en ikke-antimikrobiel kontrolforbinding eller en sølvforbinding i 3 dage (Figur 6). Blandt de testede sølvforbindinger var det kun sår behandlet med den oxygenerede saltforbinding, der fremstod mindre på makroskopiske billeder end sår behandlet med kontrolgruppen (Figur 6A-D). Kvantificering af sårareal ved hjælp af histologisk analyse viste, at det gennemsnitlige sårareal efter behandling med Ag-oxysolforbindingen var 2,35 mm2 sammenlignet med 2,96 mm2 for sår behandlet med kontrolgruppen, men denne forskel nåede ikke statistisk signifikans (p = 0,488) (Fig. 6I). Derimod blev der ikke observeret nogen reduktion i sårareal efter behandling med Ag1+ (3,38 mm2, p = 0,757) eller Ag1+ + EDTA/BC (4,18 mm2, p = 0,054) forbindinger sammenlignet med kontrolgruppen. Der blev observeret øget epitelregenerering med Ag-oxysolforbindingen sammenlignet med kontrolgruppen (henholdsvis 30 % vs. 22 %), selvom dette ikke nåede signifikans (p = 0,067). Dette er ret signifikant og bekræfter tidligere resultater. En forbinding med oxysoler fremmer reepitelisering. -Epitelisering af uinficerede sår17. I modsætning hertil havde behandling med Ag1+ eller Ag1+ + EDTA/BC-forbindinger ingen effekt eller viste nedsat reepitelisering sammenlignet med kontrolgruppen.
Effekt af sølvsårforbinding på sårheling hos uinficerede mus med komplet resektion. (AD) Repræsentative makroskopiske billeder af sår efter tre dages behandling med en ikke-antimikrobiel kontrolforbinding og en sølvforbinding. (EH) Repræsentative sårsnit farvet med hæmatoxylin og eosin. Kvantificering af sårareal (I) og procentdel af reepitelisering (J) blev beregnet ud fra histologiske snit ved sårets midtpunkt ved hjælp af billedanalysesoftware (n = 11-12 pr. behandlingsgruppe). Grafer viser gennemsnit +/- standardfejl. * gennemsnit p = <0,05.
Sølv har en lang historie med anvendelse som antimikrobiel behandling ved sårheling, men de mange forskellige formuleringer og leveringsmetoder kan resultere i forskelle i antimikrobiel effekt 18. Desuden er de antibiofilmmæssige egenskaber ved specifikke sølvleveringssystemer ikke fuldt ud forstået. Selvom værtens immunrespons er relativt effektivt mod planktoniske bakterier, er det generelt mindre effektivt mod biofilm 19. Planktoniske bakterier fagocyteres let af makrofager, men inden for biofilm udgør aggregerede celler yderligere problemer ved at begrænse værtens respons i en sådan grad, at immunceller kan undergå apoptose og frigive proinflammatoriske faktorer for at forbedre immunresponset 20. Det er blevet observeret, at nogle leukocytter kan trænge ind i biofilm 21, men ikke er i stand til at fagocytere bakterier, når dette forsvar er kompromitteret 22. En holistisk tilgang bør anvendes til at understøtte værtens immunrespons mod sårbiofilminfektion. Sårdebridering kan fysisk forstyrre biofilmen og fjerne det meste af biobyrden, men værtens immunrespons kan være ineffektivt mod den resterende biofilm, især hvis værtens immunrespons er kompromitteret. Antimikrobielle behandlinger såsom sølvforbindinger kan således understøtte værtens immunrespons og eliminere biofilminfektioner. Sammensætning, koncentration, opløselighed og leveringssubstrat kan påvirke sølvs antimikrobielle effektivitet. I de senere år har fremskridt inden for sølvforarbejdningsteknologi gjort disse forbindinger mere effektive9,23. Efterhånden som sølvforbindingsteknologien udvikler sig, er det vigtigt at forstå effektiviteten af disse forbindinger til at kontrollere sårinfektion og, endnu vigtigere, virkningen af disse potente former for sølv på sårmiljøet og helingen.
I dette studie sammenlignede vi effektiviteten af to avancerede sølvforbindinger med konventionelle sølvforbindinger, der producerer Ag1+-ioner mod biofilm, ved hjælp af forskellige in vitro- og in vivo-modeller. Vi vurderede også effekten af disse forbindinger på sårmiljøet og infektionsuafhængig heling. For at minimere indflydelsen fra leveringsmatricen bestod alle testede sølvforbindinger af carboxymethylcellulose.
Vores foreløbige evaluering af disse sølvforbindinger mod koloniale biofilm af Pseudomonas aeruginosa og Staphylococcus aureus viser, at i modsætning til traditionelle Ag1+ forbindinger er to avancerede sølvforbindinger, Ag1+ + EDTA/BC og iltede Ag-salte, effektive ved 5. De dræber effektivt biofilmbakterier inden for få dage. Derudover forhindrer disse forbindinger gendannelse af biofilm ved gentagen eksponering for planktoniske bakterier. Ag1+ forbindingen indeholdt sølvchlorid, den samme sølvforbindelse og basematrix som Ag1+ + EDTA/BC, og havde en begrænset effekt på bakteriel levedygtighed i biofilmen i samme periode. Observationen af, at en Ag1+ + EDTA/BC-forbinding var mere effektiv mod biofilm end en Ag1+ forbinding bestående af den samme matrix og en sølvforbindelse, understøtter antagelsen om, at yderligere ingredienser er nødvendige for at øge effektiviteten af sølvchlorid mod biofilm, som det er blevet rapporteret andetsteds15. Disse resultater understøtter ideen om, at BC og EDTA spiller en yderligere rolle i at bidrage til den samlede forbindingseffektivitet, og at fraværet af denne komponent i Ag1+ forbindinger kan have bidraget til den manglende demonstration af in vitro-effektivitet. Vi fandt, at iltede Ag-saltforbindinger, der producerer Ag2+ og Ag3+ ioner, udviste stærkere antibakteriel effekt end Ag1+ og på niveauer svarende til Ag1+ + EDTA/BC. På grund af det høje redoxpotentiale er det imidlertid uklart, hvor længe Ag3+ ioner forbliver aktive og effektive mod sårbiofilm, og derfor fortjener yderligere undersøgelse. Derudover er der mange forskellige forbindinger, der genererer Ag1+ ioner, som ikke blev testet i denne undersøgelse. Disse forbindinger er sammensat af forskellige sølvforbindelser, koncentrationer og basematricer, hvilket kan påvirke leveringen af Ag1+ ioner og deres effektivitet mod biofilm. Det er også værd at bemærke, at der findes mange forskellige in vitro- og in vivo-modeller, der bruges til at evaluere effektiviteten af sårforbindinger mod biofilm. Den anvendte modeltype samt salt- og proteinindholdet i de medier, der anvendes i disse modeller, vil påvirke forbindingens effektivitet. I vores in vivo-model lod vi biofilmen modnes in vitro og overførte den derefter til sårets dermale overflade. Værtsmusens immunrespons er relativt effektivt mod planktoniske bakterier, der påføres såret, hvorved der dannes en biofilm, når såret heler. Tilsætningen af moden biofilm til et sår begrænser effektiviteten af værtens immunrespons på biofilmdannelse ved at tillade den modne biofilm at etablere sig i såret, før helingen kan begynde. Vores model giver os således mulighed for at evaluere effektiviteten af antimikrobielle forbindinger på modne biofilm, før sår begynder at hele.
Vi fandt også, at forbindingens pasform påvirkede effektiviteten af sølvforbindinger på in vitro-dyrkede biofilm og svinehud. Tæt kontakt med såret anses for at være afgørende for forbindingens antimikrobielle effektivitet24,25. Forbindinger indeholdende iltede Ag-salte var i tæt kontakt med modne biofilm, hvilket resulterede i en signifikant reduktion i antallet af levedygtige bakterier i biofilmen efter 24 timer. I modsætning hertil forblev et betydeligt antal levedygtige bakterier tilbage, når de blev behandlet med Ag1+ og Ag1+ + EDTA/BC-forbindinger. Disse forbindinger indeholder suturer langs hele forbindingens længde, hvilket skaber døde rum, der forhindrer tæt kontakt med biofilmen. I vores in vitro-studier forhindrede disse ikke-kontaktområder drab af levedygtige bakterier i biofilmen. Vi vurderede først bakteriel levedygtighed efter 24 timers behandling. Over tid, efterhånden som forbindingen bliver mere mættet, kan der være mindre dødt rum, hvilket reducerer arealet for disse levedygtige bakterier. Dette understreger dog vigtigheden af forbindingens sammensætning, ikke kun typen af sølv i forbindingen.
Selvom in vitro-studier er nyttige til at sammenligne effektiviteten af forskellige sølvteknologier, er det også vigtigt at forstå virkningerne af disse forbindinger på biofilm in vivo, hvor værtsvæv og immunresponser bidrager til forbindingernes effektivitet mod biofilm. Effekten af disse forbindinger på sårbiofilm blev observeret ved hjælp af scanningselektronmikroskopi og EPS-farvning af biofilmen ved hjælp af intracellulære og ekstracellulære DNA-farvestoffer. Vi fandt, at efter 3 dages behandling var alle forbindinger effektive til at reducere cellefrit DNA i biofilm-inficerede sår, men Ag1+ forbindingen var mindre effektiv i Staphylococcus aureus-inficerede sår. Scanningselektronmikroskopi viste også, at der var signifikant færre bakterier til stede i sår behandlet med sølvforbindingerne, selvom dette var mere udtalt med den iltede Ag-saltforbinding og Ag1+ + EDTA/BC-forbindingen sammenlignet med Ag1+ forbindingen. Disse data viser, at de testede sølvforbindinger havde varierende grader af indvirkning på biofilmstrukturen, men ingen af sølvforbindingerne var i stand til at udrydde biofilmen, hvilket understøtter behovet for en holistisk tilgang til behandling af sårbiofilminfektioner; brug af sølvarmbånd. Behandlingen forudgås af fysisk debridement for at fjerne det meste af biofilmen.
Kroniske sår er ofte i en tilstand af alvorlig inflammation, hvor overskydende inflammatoriske celler forbliver i sårvævet i en længere periode, hvilket forårsager vævsskade og udtømmer den ilt, der er nødvendig for effektiv cellulær metabolisme og funktion i såret26. Biofilm forværrer dette fjendtlige sårmiljø ved at påvirke helingen negativt på en række måder, herunder hæmning af celleproliferation og -migration og aktivering af proinflammatoriske cytokiner27. Efterhånden som sølvforbindinger bliver mere effektive, er det vigtigt at forstå den indvirkning, de har på sårmiljøet og helingen.
Interessant nok, selvom alle sølvforbindinger påvirkede biofilmsammensætningen, var det kun iltede sølvsaltforbindinger, der øgede reepiteliseringen af disse inficerede sår. Disse data understøtter vores tidligere fund17 og dem fra Kalan et al. (2017)28, som viste gode sikkerheds- og toksicitetsprofiler for iltede sølvsalte, da lavere koncentrationer af sølv var effektive mod biofilm.
Vores nuværende undersøgelse fremhæver forskellene i sølvteknologi mellem antimikrobielle sølvforbindinger og denne teknologis indvirkning på sårmiljøet og infektionsuafhængig heling. Disse resultater adskiller sig dog fra tidligere undersøgelser, der viser, at Ag1+ + EDTA/BC-forbinding forbedrede helingsparametrene for skadede kaninører in vivo. Dette kan dog skyldes forskelle i dyremodeller, måletidspunkter og bakterielle påføringsmetoder29. I dette tilfælde blev sårmålinger taget 12 dage efter skaden for at give forbindingens aktive ingredienser mulighed for at virke på biofilmen over en længere periode. Dette understøttes af en undersøgelse, der viste, at klinisk inficerede bensår behandlet med Ag1+ + EDTA/BC først steg i størrelse efter en uges behandling og derefter i løbet af de næste 3 ugers behandling med Ag1+ + EDTA/BC og inden for 4 uger efter brug af ikke-antimikrobielle lægemidler. CMC-forbindinger til at reducere størrelsen af sår30.
Visse former og koncentrationer af sølv har tidligere vist sig at være cytotoksiske in vitro 11, men disse in vitro-resultater resulterer ikke altid i bivirkninger in vivo. Derudover har fremskridt inden for sølvteknologi og en bedre forståelse af sølvforbindelser og -koncentrationer i forbindinger ført til udviklingen af mange sikre og effektive sølvforbindinger. Men efterhånden som sølvforbindingsteknologien udvikler sig, er det vigtigt at forstå virkningen af disse forbindinger på sårmiljøet 31,32,33. Det blev tidligere rapporteret, at den øgede rate af reepitelisering svarer til en øget andel af antiinflammatoriske M2-makrofager sammenlignet med den proinflammatoriske M1-fænotype. Dette blev bemærket i en tidligere musemodel, hvor sølvhydrogel-sårforbindinger blev sammenlignet med sølvsulfadiazin og ikke-antimikrobielle hydrogeler 34.
Kroniske sår kan udvise overdreven inflammation, og det er blevet observeret, at tilstedeværelsen af overskydende neutrofiler kan være skadelig for sårheling35. I et studie med neutrofil-udtømte mus forsinkede tilstedeværelsen af neutrofiler reepiteliseringen. Tilstedeværelsen af overskydende neutrofiler fører til høje niveauer af proteaser og reaktive iltarter, såsom superoxid og hydrogenperoxid, som er forbundet med kroniske og langsomt helende sår37,38. Ligeledes kan en stigning i makrofagtallet, hvis det ikke kontrolleres, føre til forsinket sårheling39. Denne stigning er især vigtig, hvis makrofager ikke er i stand til at overgå fra en proinflammatorisk fænotype til en pro-helende fænotype, hvilket resulterer i, at sår ikke forlader den inflammatoriske helingsfase40. Vi observerede et fald i neutrofiler og makrofager i biofilm-inficerede sår efter 3 dages behandling med udelukkende sølvforbindinger, men faldet var mere udtalt med iltede saltforbindinger. Dette fald kan være et direkte resultat af immunresponset på sølv, en reaktion på nedsat biobyrde, eller at såret er i et senere helingsstadium, og derfor er immuncellerne i såret reduceret. Reduktion af antallet af inflammatoriske celler i såret kan opretholde et miljø, der er befordrende for sårheling. Virkningsmekanismen for, hvordan Ag-oxysalte fremmer infektionsuafhængig heling, er uklar, men Ag-oxysaltes evne til at producere ilt og ødelægge skadelige niveauer af hydrogenperoxid, en mediator af inflammation, kan forklare dette og kræver yderligere undersøgelse17.
Kroniske, ikke-helende, inficerede sår udgør et problem for både læger og patienter. Selvom mange bandager hævder at være antimikrobielle, fokuserer forskningen sjældent på andre nøglefaktorer, der påvirker sårets mikromiljø. Denne undersøgelse viser, at forskellige sølvteknologier har forskellig antimikrobiel effekt og, vigtigst af alt, forskellige effekter på sårmiljøet og helingen, uafhængigt af infektion. Selvom disse in vitro- og in vivo-studier viser effektiviteten af disse bandager til behandling af sårinfektioner og fremme af heling, er der behov for randomiserede, kontrollerede forsøg for at evaluere effektiviteten af disse bandager i klinikken.
De datasæt, der er anvendt og/eller analyseret i den aktuelle undersøgelse, er tilgængelige fra den korresponderende forfatter efter rimelig anmodning.
Opslagstidspunkt: 15. juli 2024